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麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中的表达及活性分析

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麦芽糖转糖基酶是一种4-α-葡聚糖转移酶,能催化直链淀粉环化生成大环糊精。大环糊精具有筒状疏水内腔和亲水外表结构,可以广泛应用于食品、医药、化工等行业。麦芽糖转糖基酶在生物(包括微生物)体内含量很低,不能满足制备大环糊精和科研的需要。本文从E.coli BL21(DE3)plysS中扩增得到麦芽糖转糖基酶基因(MalQ),构建了表达载体pPIC9K-MalQ,Sal I线性化,电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115感受态细胞中,成功构建了一株基因工程菌。pPIC9K-MalQ／GS115。利用0.8％甲醇诱导表达,表达上清进行转糖基活性分析,TLC结果显示表达上清液具有糖基转移酶作用,证实麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中成功表达。表达产生的麦芽糖转糖基酶和直链淀粉反应,制备得到一系列大环糊精的混合物。本文主要结论如下:
　　 (1)PCR扩增得到的MalQ基因,构建了表达载体pPIC9K-MalQ。对其进行酶切和测序分析。测序结果经BLAST比对,与GenBank中报道的E.coliBL21(DE3)MalQ基因的同源性为100％。
　　 (2)表达载体用Sal I线性化,电击转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中,构建了基因工程菌pPIC9K-MalQ／GS115。0.8％甲醇进行诱导表达。表达上清液与麦芽糖溶液反应,TLC结果显示:上清液具有糖基转移酶活性。SDS-PAGE电泳显示,上清液在78.5kDa位置处有明显条带,与麦芽糖转糖基酶的理论分子量相符。葡萄糖氧化酶法测得表达上清液酶活118U。证实麦芽糖转糖基酶在毕赤酵母中成功表达。确定了该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.0。
　　 (3)基因工程菌pPIC9K-MalQ／GS115的表达上清液与直链淀粉反应,葡萄糖淀粉酶初步纯化,TLC结果显示:有聚合度大于9的一系列环状糊精生成。证实麦芽糖转糖基酶能催化淀粉生成大环糊精。

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