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氟离子注入钛表面改性对成骨细胞和牙龈卟啉单胞菌相互作用的影响

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摘要

目的:本实验应用氟离子注入技术，综合评价氟离子注入纯钛前后表面体征以及氟离子注入前后纯钛材料对成骨细胞和牙龈卟啉单胞菌相互作用的影响，建立细菌、细胞与材料界面间的接触关系，模拟种植体周围炎的模型，综合评价氟离子注入前后材料表面的成骨细胞和牙龈卟啉单胞菌相互作用的影响，从而为探索出一种既具有抗菌性又具有生物相容性的新型种植材料提供了有利的条件。
　　 方法:
　　 一、氟离子注入纯钛表面制备及微观表征
　　 1、材料的制备
　　 将钛片加工成厚度为1mm、直径为30mm的钛片，表面砂纸打磨、机器抛光至镜面后分为实验组（氟离子注入的钛片）和对照组（纯钛片）两组。离子注入源为四氟化碳，氟离子注入设备由哈尔滨工业大学提供的自行研发的第三代等离子注入设备。
　　 2、物理特性分析
　　 材料表面化学元素的分析:PHI-5700ESCA型X线光的电子能谱分析系统。
　　 二、氟离子注入钛表面改性对成骨细胞和牙龈卟啉单胞菌相互作用的影响
　　 1、细胞增值实验
　　 用DMEM培养基将P.g悬液稀释成108CFU/ml，用于置换培养板中的细胞培养液，分别培养3小时，6小时，9小时，12小时，24小时。将MG-63制成5×103cells/ml的细胞悬液，接种于96孔板中，复种2孔，培养基用CCK-8溶液置换（CCK-8∶培养基=1∶10），培养4h后，用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光度值。
　　 2、碱性磷酸酶活性实验
　　 用DMEM培养基将P.g悬液稀释成108CFU/ml，用于置换培养板中的细胞培养液，分别培养3小时，6小时，9小时，12小时，24小时后弃去培养液，0.01mol/LPBS漂洗细胞3次，用Ttrion-X100细胞裂解液裂解细胞，12000r/min4°离心15min，各取30uL裂解细胞与100uL碱性磷酸酶反应底物混匀，水浴15min后放入96孔板再加150ul显色剂，在酶标仪405nm波长下读取ALP活性的OD值，取平均值.其数值大小可以反映ALP活性的高低.
　　 3、实时定量PCR实验
　　 实验分为无菌组和有菌组，无菌组分别将成骨细胞接种到氟离子注入钛片和纯钛片过夜，再继续培养6小时后进行实时定量PCR检测;有菌组将成骨细胞接种到氟离子注入钛片和纯钛片培养过夜后，用DMEM培养基将P.g悬液稀释成108CFU/ml置换原培养基，继续培养6小时后，进行实时定量PCR检测。
　　 结果:
　　 一、氟离子注入钛表面改性材料的微观表征
　　 XPS宽程扫描分析显示，氟离子注入前出现氧、碳、钛三种元素;氟离子注入后出现氧、碳、钛、氟四种元素，比未进行氟离子注入的纯钛表面多了一个氟元素。
　　 二、氟离子注入钛表面改性对成骨细胞和牙龈卟啉单胞菌相互作用的影响
　　 1、CCK-8法细胞毒实验分析结果
　　 氟离子注入钛片表面在牙龈卟啉单胞菌作用下的成骨样细胞MG-63的细胞增殖数量明显多于对照组纯钛表面，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2、ALP法分析结果
　　 所有材料表面在P.g作用下的MG-63细胞活性随着培养时间的增加而减少，氟离子注入纯钛表面的细胞ALP活性比未注入的纯钛组高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3、REAL-TIMEPCR分析结果
　　 无菌情况下，氟离子注入纯钛表面OPG和RANKLmRNA较纯钛材料表面无显著差异;在加入牙龈卟啉单胞菌作用下，氟离子注入组材料表面OPGmRNA表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05);RANKLmRNA表达下降，无显著差异。
　　 结论:
　　 1、纯钛材料表面化学元素为氧、碳和钛三种元素;氟离子注入纯钛材料表面化学元素为氧、碳、钛和氟四种元素，即新加入了氟元素。
　　 2、氟离子注入纯钛改性材料表面在牙龈卟啉单胞菌作用下的成骨细胞增殖数量较纯钛材料表面多，具有显著统计学差异。
　　 3、氟离子注入纯钛改性材料表面在牙龈卟啉单胞菌作用下的成骨细胞碱性磷酸酶活性较纯钛材料表面高，更有利于成骨细胞的生长，差异有统计学意义。
　　 4、无菌情况下，氟离子注入纯钛表面OPG和RANKLmRNA较纯钛材料表面无显著差异;在加入牙龈卟啉单胞菌作用下，氟离子注入组材料表面OPGmRNA表达上调，差异有统计学意义(P＜0.05);RANKLmRNA表达下降，无显著差异。

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