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大菱鲆白化病相关基因(DEN-1、DEN-2)的分离鉴定及特征分析

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1前言

1.1大菱鲆生物学特征和相关基因的研究进展

1.1.1大菱鲆生物学特征和人工养殖

1.1.2大菱鲆相关基因的研究

1.2鱼类白化病研究进展

1.2.1鲆鲽鱼类白化病的形态特征

1.2.2鲆鲽鱼类白化病的诱因研究进展

1.2.3黑色素生物合成及鱼类白化分子机制研究进展

1.3 mRNA差异显示技术在基因差异表达研究中的应用

2实验部分

2.1材料与方法

2.1.1大菱鲆的采集

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4方法

2.2结果

2.2.1总RNA的提取与检测

2.2.2差异显示结果及差异显示基因片段的重扩增和回收纯化

2.2.3差异表达基因片段的测序与序列分析

2.2.4差异表达基因片段的验证与4种皮肤组织表达谱

2.2.5基因片段的电子延伸与电子表达谱

3讨论

3.1序列及同源性比较结果

3.1.1序列结果的分析

3.1.2与已知基因高度同源的差异序列分析

3.1.3与未知基因同源的差异序列和低同源性序列的分析

3.2差异显示中假阳性的判断

3.3差异表达基因片段在4种皮肤组织中的表达谱

3.4电子克隆与电子表达谱

4.结论

参考文献

附录

致谢

个人简历

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摘要

大菱鲆是我国在上世纪90年代引进的名贵海水养殖鱼类,养殖规模较大。在苗种生产过程中常出现大规模的白化现象,白化大菱鲆商品价值大大降低。鲆鲽鱼类白化的分子机制一直是国内外未能解决的热点问题,因此,克隆鱼类白化相关基因具有重要意义。 本研究应用mRNA差异显示技术,对正常与白化大菱鲆有眼侧皮肤组织进行了对比研究,克隆差异表达基因,共分离到22条大菱鲆白化相关基因片段,片段长度100~1200 bp左右。经测序、RT-PCR验证,差异表达基因片段DEN-1(GenBank登录号:DQ886390)与DEN-2(GenBank登录号:DQ886391)均在白化大菱鲆有眼侧皮肤组织中下调表达;通过BLAST检索发现,DEN-1 与 GenBank 中的斑马鱼和牛的类似尿苷二磷酸-葡萄糖:糖蛋白葡萄糖基转移酶(UGGT)基因、与挪威鼠类似尿苷二磷酸-葡萄糖:神经酰氨葡萄糖基转移酶 1(Ugcg11)基因有较高同源性;DEN-2 与原鸡、斑马鱼、人、挪威鼠、家鼠和狗的眼缺乏同源框4(eya4)基因的同源性均较高。这些结果也同样得到了BLASTX 结果的证实。同源性较低的片段可能为未知新基因,对这些序列信息进行进一步研究将有助于获得完整基因和了解大菱鲆白化的分子机制。 采用相对定量RT-PCR对正常鱼有眼侧皮肤(N1)、白化鱼有眼侧皮肤(A1)、正常鱼无眼侧皮肤(N2)、白化鱼无眼侧皮肤(A2)进行表达谱分析,以内参β-actin基因分别对DEN-1和DEN-2表达量进行标准化的光密度扫描显示:DEN-1和DEN-2在4种皮肤组织中有相似的表达模式,其表达量为:N1>N2-A2>A1。电子延伸将DEN-2延伸为497 bp的片段,该延伸片段与多种动物的eya4基因在核酸和蛋白水平均有很高同源性。本研究对DEN-1和DEN-2的不同组织器官和不同发育阶段的电子表达谱分析,将对其进一步研究提供有价值参考。

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