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BCG对感染啮齿类疟原虫C57BL/6小鼠免疫应答的影响及其机制研究

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摘要

疟疾是疟原虫通过媒介昆虫蚊传播的一种对人类健康危害极为严重的寄生原虫感染性疾病。2010年WHO疟疾报告显示全球约33亿人口受到疟疾威胁。在疟疾流行区，疟原虫与结核、艾滋病、蠕虫等其他病原体共同感染现象十分常见并普遍存在。疟原虫与发病率第一位的结核共同感染是近年来凸显的公共卫生问题。然而，关于结核对疟疾感染进程和结局的影响及其相关机制尚不明确。因此，探讨疟疾流行区病原体之间的相互作用特点，特别是对疟疾免疫应答的影响及其相关机制，不仅可进一步充实对疟疾免疫的认识，而且无疑将为揭示疟疾流行区病原体相互作用的细胞和分子机制提供新的理论依据。
　　 血清流行病学研究已经揭示流行区疟疾发生的一些鲜明特征，严重炎症反应导致脑疟等免疫病理损伤是5岁以下儿童死亡的主要原因，然而，反复暴露于疟原虫感染的个体可逐步建立低原虫血症水平的带虫免疫。调控保护性与病理性免疫平衡无疑是疟疾防控的关键。啮齿类疟原虫感染小鼠为深入探讨抗人疟保护性免疫应答机制，提供了一种宝贵的实验动物模型。啮齿类动物模型的研究数据显示，不同小鼠在感染同种疟原虫时，会出现死亡和自愈两种截然不同的结局。同一小鼠感染不同疟原虫时，会出现免疫保护或免疫病理两种不同的免疫应答模式。C57BL/6小鼠感染夏氏疟原虫后可以自愈，但感染伯氏疟原虫后可诱导致死的神经系统疾病(通常称为实验性脑型疟疾)。在疟原虫感染早期，以IFN-γ分泌增加为主的Th1型细胞免疫应答遏制疟原虫的爆发性增殖。随之，由Th2型细胞辅助B细胞产生特异性抗体，能够有效地清除疟原虫，防止复发和再燃。过度的Th1免疫应答及前炎症细胞因子分泌会造成病理损伤或引起宿主死亡。由此表明：抗疟保护性免疫依赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡。
　　 作为活化初始T细胞的专职抗原提呈细胞(antigen present cell，APC)，树突状细胞(dendritic cell，DC)在固有和适应性免疫应答协调建立过程中起到了关键的桥梁作用。前期的实验证明，致死型约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii17XL，P.y17XL)感染BALB/c小鼠和DBA/2小鼠，DC的分化模式及成熟表型的特征分子在表达水平上均存在显著的差异。与其他大多数感染性疾病一样，红内期疟原虫诱导宿主产生的抗感染免疫效应可对其施加控制。啮齿类动物模型和人类研究的数据显示，Treg在疟原虫感染过程中出现明显活化与增殖。Treg可调控疟疾急性期前炎症应答和/或Th1记忆反应，Treg通过与免疫细胞直接接触和产生调控性细胞因子IL-10和TGF-β抑制细胞免疫应答。我们前期的研究结果也证实，P.y17XL感染早期，BALB/c小鼠脾细胞培养上清中产生的高水平IL-10是抑制Th1细胞免疫应答效应强度的关键因素。
　　 疟疾与其他病原体共同感染在疟疾流行区较为常见，其中有的病原体共同感染可提高宿主抗疟免疫的保护效应并能抑制疟疾的发生。研究显示，TB感染可诱导宿主产生CD4+Th1应答，消除IFN-γ的小鼠感染TB加速小鼠死亡。BCG是TB减毒活疫苗，能够启动以分泌IFN-γ为主的Th1细胞免疫反应，并进一步活化巨噬细胞吞噬TB。BCG预先免疫小鼠感染P.y17XL后，可迅速建立以IFN-γ升高为主的Th1应答，同时虫体血症水平也显著低于未接种BCG的对照鼠，并具较高生存率；BCG免疫的C57BL/6小鼠对P.c chabaudi AS感染呈现显著的易感性。此外，BCG预先免疫的Wistar大鼠也可抑制红外期疟原虫的发育。然而疟疾感染发生后，免疫接种BCG是否能诱导宿主产生有效的免疫保护，尤其是能否降低CM的发生风险目前尚不清楚。有关于BCG对疟疾免疫应答的影响及其相关机制尚需进一步明确。
　　 本研究利用可诱导免疫保护或免疫病理两种不同感染结局的疟原虫与不同时相BCG共同感染鼠疟模型，动态观察BCG对小鼠感染进程与感染结局的影响。特别是通过对比分析宿主固有免疫和适应性免疫应答特点，旨在进一步揭示疟原虫与BCG共同感染的相关细胞和分子机制，以期为疟疾流行区新的防控策略的确立提供理论依据。
　　 实验方法：
　　 1、实验动物及模型构建
　　 (1)6～8周龄，雌性C57BL/6小鼠经腹腔感染分别感染1×106P.c chabaudi AS与P.6 ANKA寄生红细胞。
　　 (2)感染P.c chabaudi的C57BL/6小鼠分别于感染前4w、0d及感染后第3d尾静脉给予BCG。每只鼠0.05mg。
　　 (3)感染.P.b ANKA的C57BL/6小鼠分别于感染前3d、0d及感染后第3d尾静脉给予BCG。每只鼠0.05mg。
　　 2、脾细胞荧光抗体染色
　　 无菌取出感染前(第0d)和感染后第3d、5d、8d、12d小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17 mol/L NH4Cl裂解红细胞。以含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。每份样品用抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体和抗-CD45R/B220-PerCP单克隆抗体进行三色分析，另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-CD11b-PE单克隆抗体和抗-CD45R/B220-PerCP单克隆抗体进行表面染色。离心去上清后，用0.5ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。每份样品用抗-CD11c-FITC单克隆抗体和抗-MHCⅡ-PE单克隆抗体、或抗-CD80-PE单克隆抗体进行双色分析，另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD11c-FITC单克隆抗体、抗-MHCⅡ-PE单克隆抗体和抗-CD80-PE单克隆抗体。离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。每份样品用抗-CD4-FITC单克隆抗体和抗-CD69-PE单克隆抗体进行双色分析，另设阴性对照管。在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗-CD4-FITC单克隆抗体和抗-CD69-PE单克隆抗体。离心去上清后，用0.5 ml细胞染色缓冲液重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。每份样品用抗CD4-FITC和抗CD25-PE单抗进行表面染色，固定透膜后，用抗Foxp3-APC单抗进行胞内染色，用含1% FCS的PBS洗涤两次并悬浮于0.5 ml PBS中，流式细胞仪进行检测。
　　 3、IFN-γ、TNF-α，和IL-10定量检测
　　 用ELISA试剂盒分别检测脾细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α及IL-10的分泌水平。酶标仪测定450nm处OD值。实验操作按照试剂盒说明书进行，结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro4.3.1Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。
　　 4、统计学分析
　　 使用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，标本采用独立样本t检验比较分析组内和组间均值差异。P<0.05为显著差异。
　　 实验结果：
　　 1、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠的原虫血症水平和生存率
　　 P.c chabaudi AS感染后第5d，小鼠的外周血中可见疟原虫感染的红细胞，随后感染率迅速升高。于感染后第9～10d，红细胞感染率达到峰值(15.4%)，而后开始逐渐下降，小鼠于感染后第22d自愈。P.c+B、P.c-3-B组小鼠的感染模式与P.c chabaudi AS单独感染(P.c组)基本一致。然而，B-4w-P.c组小鼠于感染后第6～19d红细胞感染率显著升高，于感染后第11d达到峰值(44.3%)，并于感染后第15～20d全部死亡。
　　 P.b ANKA感染后第3d，小鼠的外周血中可见疟原虫感染的红细胞，随后红细胞感染率缓慢上升并维持在较低水平(<10%)，于8～10d全部死于CM。B-3-P.b、P.b+B组小鼠感染模式和P.b ANKA单独感染基本一致，小鼠在感染后第8～10d全部死于CM。然而，P.b-3-B组小鼠于感染后第5～7d红细胞感染率显著低于P.bANKA单独感染小鼠，并于第9d开始显著升高，66.7%的小鼠生存期延长，于感染后第20d死于贫血。
　　 2、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾DC亚群百分率
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS单独感染小鼠脾细胞中mDC和pDC数量均出现明显增加，P.c+B、P.c-3-B组小鼠与P.c chabaudi AS单独感染小鼠在DC亚群数量上无显著差异。然而，B-4w-P.c组小鼠mDC和pDC数量均显著低于P.c chabaudi AS单独感染组。
　　 与感染前相比，P.b ANKA单独感染小鼠脾细胞中mDC和pDC数量于感染后第5d、8d出现有意义增加，B-3-P.b、P.b+B组小鼠与P.b ANKA单独感染小鼠在DC亚群数量上无显著差异。然而，P.b-3-B组小鼠感染后第5d和8d mDC的数量以及感染后第8d pDC数量均显著低于P.b ANKA单独感染组小鼠。
　　 3、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾DC表面分子CD80和MHCⅡ表达水平
　　 与感染前相比，P.c chabaudi AS单独感染组于感染后第8d，DC表面分子CD80表达水平出现明显增加，P.c+B、P.c-3-B组小鼠与P.c chabaudi AS单独感染小鼠CD80分子的表达无显著差异，但B-4w-P.c组小鼠CD80表达水平显著低于P.cchabaudi AS单独感染组。
　　 于感染后第5d、8d，P.b ANKA单独感染小鼠DC表面分子CD80表达水平明显增加，B-3-P.b、P.b+B组小鼠与P.b ANKA单独感染小鼠CD80分子的表达无显著差异。而感染后第8d，P.b-3-B组小鼠CD80的表达显著低于P.b ANKA单独感染组。
　　 与感染前相比，P.c chabaudi AS单独感染后第8d，DC表面MHCⅡ分子表达水平明显增加，P.c+B、P.c-3-B组小鼠与P.c chabaudi AS单独感染小鼠MHCⅡ分子表达无显著差异，但B-4w-P.c组小鼠DC表面MHCⅡ分子的表达显著低于P.cchabaudi AS单独感染组。
　　 感染后第5d、8d，P.b ANKA单独感染组DC表面MHCⅡ分子表达水平明显增加，B-3-P.b、P.b+B组小鼠与P.b ANKA单独感染小鼠MHCⅡ分子的表达无显著差异。然而，P.b-3-B组小鼠DC表面MHCⅡ分子的表达显著低于P.b ANKA单独感染组。
　　 4、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾CD4+CD69+T细胞百分率
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS单独感染小鼠CD4+CD69+T细胞均出现明显增加，P.c+B、P.c-3-B组小鼠与其上无统计学差异。然而，B-4w-P.c组小鼠CD4+CD69+T细胞数量显著低于P.c chabaudi AS单独感染小鼠。
　　 于感染后第5d、8d，P.b ANKA单独感染小鼠CD4+CD69+T细胞都出现明显增加，B-3-P.b和P.b+B组小鼠与其无统计学差异，而P.b-3-B组小鼠CD4+CD69+T细胞的数量显著低于P.b ANKA单独感染小鼠。
　　 5、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+Treg百分率
　　 与感染前相比，感染后第5d和12d，P.c chabaudi AS感染小鼠Treg细胞出现明显升高，P.c+B、P.c-3-B组小鼠与其无统计学差异。然而，在感染后第5d、8d，B-4w-P.c组小鼠Treg细胞数量显著高于于P.c chabaudi AS单独感染小鼠，在感染后第12d，则Treg明显低于P.c chabaudi AS单独感染小鼠。
　　 与感染前相比，感染后第8d，P.6 ANKA单独感染小鼠Treg出现明显升高，B-3-P.b和P.b+B组小鼠与其无统计学差异。然而，P.b-3-B组小鼠Treg的数量在感染后5d、8d，均显著高于P.b ANKA单独感染小鼠。
　　 6、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ的含量
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d和12d，P.c chabaudi AS单独感染小鼠脾细胞IFN-γ分泌出现明显增加，P.c+B和P.c-3-B组小鼠与其无显著差异。反之，B-4w-P.c组小鼠IFN-γ水平显著低于P c chabaudi AS单独感染小鼠。
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d，P.b ANKA单独感染小鼠脾细胞IFN-γ分泌出现明显增加，B-3-P.b和P.b+B组小鼠与其无统计学差异。P.b-3-B组小鼠IFN-γ含量显著低于P.b ANKA单独感染小鼠。
　　 7、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾细胞培养上清中TNF-α的含量
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS单独感染小鼠脾细胞TNF-α分泌出现明显增加，P.c+B和P.c-3-B组小鼠与其无显著差异。然而，B-4w-P.c组小鼠TNF-α的含量显著低于P.c chabaudi AS单独感染小鼠。
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d，P.b ANKA单独感染小鼠脾细胞TNF-α分泌出现明显增加，B-3-P.b和P.b+B组小鼠与其无统计学差异。P.b-3-B组小鼠在感染后第5d，TNF-α的含量显著低于P.b ANKA单独感染小鼠。
　　 8、BCG分别与两种疟原虫共同感染小鼠脾细胞培养上清中IL-10的含量
　　 与感染前相比，感染后第5d、8d，P.c chabaudi AS单独感染小鼠脾细胞IL-10分泌出现明显增加，而在感染后第12d，IL-10分泌显著降低，P.c+B和P.c-3-B组小鼠与其无显著差异。然而，B-4w-P.c组小鼠IL-10的含量在感染后第5d、8d，显著低于P.c chabaudi AS单独感染小鼠，而在感染后第12d，IL-10分泌显著高于P.cchabaudi AS单独感染小鼠。
　　 与感染前相比，感染后第5d，P.b ANKA单独感染小鼠脾细胞IL-10分泌水平出现显著增加，感染后第8d，其分泌水平显著降低。P.b+B和B-3-P.b组小鼠与其无明显差异，而P.b-3-B组小鼠IL-10分泌水平显著高于P.b ANKA单独感染小鼠。
　　 结论：
　　 1.BCG与P.c chabaudi AS同时感染或P.c chabaudi AS感染3天后再感染BCG小鼠的感染过程和结局与单独感染P.c chabaudi AS小鼠基本一致，而BCG感染4周后再感染P.c chabaudi AS则显著提高小鼠原虫血症水平而导致小鼠死亡。
　　 2.BCG与P.b ANKA同时感染或BCG感染3天后再感染P.b ANKA小鼠的感染过程和结局与单独感染P.b ANKA小鼠基本一致，而P.b ANKA感染3天后再感染BCG小鼠生存期显著延长，且无CM发生。
　　 3.BCG与P.c chabaudi AS同时感染或P.c chabaudi AS感染3天后再感染BCG小鼠的DC亚群数量、分化与单独感染P.c chabaudi AS小鼠无明显差异。而BCG感染4周后再感染P.c chabaudi AS可降低小鼠DC亚群数量同时降低小鼠DC表面CD80和MHCⅡ分子表达水平，抑制DC的增殖分化和成熟。
　　 4.BCG与P.b ANKA同时感染或BCG感染3天后再感染P.b ANKA小鼠的DC亚群数量、分化与单独感染P.b ANKA小鼠无明显差异。然而，P.b ANKA感染3天后再感染BCG可降低小鼠DC亚群数量同时降低小鼠DC表面CD80和MHCⅡ分子表达水平，抑制DC的增殖分化和成熟。
　　 5.BCG感染4周后再感染P.c chabaudi AS小鼠通过活化Treg抑制前炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α的产生，抑制Th1免疫应答的建立，不能对小鼠产生免疫保护。
　　 6.P.b ANKA感染3天后再感染BCG小鼠通过活化Treg和抑制性细胞因子IL-10对Th1免疫应答起抑制作用，调控前炎症细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌。

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