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MO感染ALI绵羊支气管上皮细胞过程中MyD88依赖TLR信号调节与ROS诱导细胞凋亡的研究

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摘要

第一章 文献综述

1.1 绵羊肺炎支原体的发现

1.1.1 国内外研究现状

1.2 Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)信号通路

1.2.1 TLRs的发现

1.2.2 TLRs的结构组成

1.2.3 TLRs信号转导机制

1.2.4 TLRs在肺炎支原体致病机制中的研究进展

1.3 细胞死亡信号途径

1.3.1 细胞凋亡信号途径

1.3.2 细胞坏死信号途径

1.3.3 肺炎支原体对细胞凋亡的调控作用

1.4 研究目的及意义

第二章 绵羊支气管上皮细胞ALI培养模型的建立和MO的感染

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 数据分析

2.3 结果与分析

2.3.1 绵羊支气管上皮细胞的形态学特征

2.3.2 ALI绵羊支气管上皮细胞的形态学鉴定

2.3.3 绵羊支气管细胞类型表面标志分子鉴定

2.3.4 ALI绵羊支气管上皮细胞细胞类型表面标志分子鉴定

2.3.5 ALI绵羊支气管上皮细胞与MO结合位点鉴定

2.4 讨论

第三章 MyD88依赖TLR信号在ALI细胞抗MO感染中的免疫调节作用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.2.3 数据分析

3.3 结果与分析

3.3.1 BIOanalyzer RNA质量分析

3.3.2 MyD88依赖信号介导绵羊支气管上皮细胞抗MO感染的炎症反应机制

3.3.3 MO感染诱导支气管上皮细胞的炎症反应

3.4 讨论

第四章 MO感染产生ROS诱导绵羊支气管上皮细胞凋亡的分子机制

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.2 实验方法

4.2.3 数据分析

4.3 结果与分析

4.3.1 MO感染中呈现出剂量依赖性细胞毒性的特性

4.3.2 MO在感染中诱导上皮细胞产生ROS,NO

4.3.3 ROS和NO对MO感染过程中细胞凋亡与坏死的影响

4.3.4 Tunel原位末端细胞凋亡小体检测

4.3.5 ROS在MO感染中对支气管上皮细胞凋亡的调控作用

4.4 讨论

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

致谢

作者简介

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摘要

绵羊支原体肺炎,又称绵羊传染性胸膜肺炎,是由绵羊肺炎支原体(Mycoplasmaovipneumoniae,MO)引起的一种世界性的传染病。该病可见于绵羊和山羊,也可感染野生动物如大角羊等。绵羊支原体肺炎是以咳嗽、喘气、渐进性消瘦以及肺间质的增生性炎症等为主要临床特征的高度接触性呼吸道传染病。但由于与其他支原体相比,国内外有关绵羊肺炎支原体致病机理的研究非常有限,目前对于绵羊肺炎支原体的感染也尚无有效的防制手段。因此,在细胞和分子水平上阐明绵羊肺炎支原体主要致病因子及其致病机理是有效防制绵羊肺炎支原体感染的基础。
  本研究拟在建立可模拟体内支气管上皮环境的滩羊支气管上皮细胞气液相(Air-liquidinterface,ALI)培养模型的基础上,首先对ALI支气管上皮细胞与正常绵羊支气管上皮组织的细胞形态学组成学进行初步分析,进而利用这一上皮细胞培养模型探讨绵羊肺炎支原体模式株Y98与绵羊支气管上皮细胞粘附、诱发宿主免疫学反应和细胞损伤过程中的分子机制,从而为阐明绵羊肺炎支原体感染支气管上皮细胞的分子致病机理奠定基础。研究发现,ALI培养模型能够使绵羊支气管上皮原代细胞分化为带有极性的纤毛细胞、杯状细胞、分泌细胞和基底细胞等不同类型的上皮细胞,并形成细胞间紧密连接的假复上皮层结构。这一上皮样结构组成使得上皮细胞的跨膜电阻和纤毛的极化和分化,黏液蛋白的分泌,顶端微气道腔等的微环境都与正常组织相似。通过激光共聚焦显微镜观察发现,在感染初期肺炎支原体迅速定殖于支气管假复层结构中的纤毛细胞,并且随着感染时间的延长,肺炎支原体在上皮纤毛细胞中更均匀地分布,而无纤毛区域未见到有支原体定植。此外,在绵羊肺炎支原体感染ALI绵羊支气管上皮细胞的过程中,Toll受体(TLR)信号接头分子MyD88及依赖其信号通路中下游因子的表达量均有显著上调,包括IRAKs,TRAF6和NF-κB,进而导致促炎因子和相关细胞因子的上调。相反,MyD88非依赖TLR通路中的信号因子TBK1,IRF3和TRAF3的表达量均没有变化。这些结果说明,MyD88依赖TLR信号通路在ALI绵羊支气管上皮细胞响应绵羊肺炎支原体感染过程中起着关键的作用。同时,支原体激活宿主细胞TLR信号通路后,细胞会释放大量促炎细胞因子,从而影响MAPK信号途径的转导和细胞凋亡的调控。研究发现,在支原体激活宿主细胞TLR信号通路后,细胞释放大量促炎细胞因子,诱导促凋亡因子P38磷酸化,促凋亡因子Bax/抗凋亡因子Bcl-2蛋白比例升高,从而激活MAPK途径诱导细胞凋亡。有意思的是,这些信号因子均能被活性氧(ROS)所调控。这些结果说明,在感染过程中,支原体通过改变抗凋亡因子ERK和促凋亡因子P38/MAPK之间的动态平衡,促凋亡/抗凋亡蛋白比值以及caspase家族蛋白的活性,同时介导细胞的胞内凋亡和胞外凋亡途径,最终导致宿主细胞的凋亡。
  以上研究结果揭示,MyD88依赖信号与ROS介导细胞凋亡在绵羊支气管上皮细胞抗肺炎支原体感染的免疫调控机制中发挥着关键作用。这些发现为进一步研究肺炎支原体感染的致病机理提供新的思路,以及为临床防治绵羊肺炎支原体感染的研究提供新的靶点。

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