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里氏木霉胞外蛋白酶的表达调控及纤维素酶的酶系改良

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符号说明及缩略词

第一章 研究背景及意义

1．1 里氏木霉—纤维素酶工业生产菌株

1．1．1 里氏木霉的发现与研究进展

1．1．2 里氏木霉纤维素降解酶系

1．1．3 里氏木霉纤维素酶系的表达调控

1．1．4 里氏木霉纤维素酶系优化和菌种改良

1．2 丝状真菌蛋白酶研究现状

1．2．1 蛋白酶的分类

1．2．2 蛋白酶表达调控

1．2．3 蛋白酶的作用

1．3 丝状真菌氮源代谢

1．3．1 丝状真菌铵盐同化

1．3．2 铵盐代谢的全局调控

1．3．3 氮源调控因子AreA的功能

1．4 类p53转录因子XprG／VIB1

1．4．1 酵母类p53转录因子Ndt80的功能

1．4．2 构巢曲霉类p53转录因子XprG的功能

1．4．3 粗糙脉孢菌类p53转录因子VIB-1的功能

1．5 本研究的目的和意义

2．1 引言

2．2 实验材料与方法

2．2．1 菌株、培养基及PCR引物

2．2．2 培养条件

2．2．3 酶、试剂和试剂盒

2．2．4 主要实验仪器

2．2．5 常用试剂和缓冲液

2．2．6 分子生物学操作方法

2．2．7 蛋白酶敲除菌株的构建

2．2．8 生长及碳氮源利用情况的测定

2．2．9 蛋白酶平板分析

2．2．10 纤维素酶活力和蛋白酶测定

2．2．11 蛋白质组实验流程

2．2．12 生物信息学软件及分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 玉米浆培养发酵后期纤维素酶活力出现降低

2．3．2 不同培养条件下里氏木霉胞外蛋白酶的生成和变化

2．3．3 发酵前后期蛋白质组学的分析和比较

2．3．4 里氏木霉分泌蛋白酶生物信息学分析

2．3．5 蛋白酶缺失菌株构建

2．3．6 缺失蛋白酶对菌株碳源利用的影响

2．3．7 缺失蛋白酶对菌株氮源利用的影响

2．3．8 蛋白酶缺失菌株的蛋白酶平板分析

2．3．9 敲除蛋白酶对里氏木霉胞外纤维素酶的影响

2．3．10 蛋白酶敲除菌株发酵酶液的SDS-PAGE分析

2．3．11 蛋白酶敲除菌株明胶酶谱分析

2．3．12 多蛋白酶敲除菌株的构建

2．3．13 缺失蛋白酶对菌株碳源利用的影响

2．3．14 缺失蛋白酶对菌株氮源利用的影响

2．3．15 三蛋白酶基因敲除菌株的蛋白水解能力分析

2．3．16 三蛋白酶缺失菌株的胞外蛋白酶和纤维素酶活力分析

2．4 本章小结

第三章 里氏木霉广域氮源调控因子Are1的功能分析

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 菌株、培养基及PCR引物

3．2．2 培养条件

3．2．3 酶、试剂和试剂盒

3．2．4 主要实验仪器

3．2．5 常用试剂和缓冲液

3．2．6 分子生物学操作方法

3．2．7 突变菌株的构建

3．2．8 碳、氮利用情况分析

3．2．9 纤维素酶活力测定

3．2．10 生物信息学软件及分析

3．2．11 RNA的提取和检测

3．2．12 RNA-seq分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 里氏木霉氮源调控因子的鉴定与分析

3．3．2 里氏木霉氮源调控因子Are1的鉴定分析

3．3．3 里氏木霉氮源调控因子Are1基因的表达

3．3．4 Are1缺失不影响菌株对碳源的利用

3．3．5 Are1缺失影响菌株对氮源的利用

3．3．6 Are1缺失影响菌株对氨基酸的利用

3．3．7 Are1缺失影响孢子生成

3．3．8 Are1调控里氏木霉蛋白酶的表达

3．3．9 RNA-seq揭示Are1对里氏木霉生长发育和氮源利用的影响

3．3．10 RNA-seq测序初步揭示Are1在里氏木霉氮源利用中的作用

3．3．11 Δare1菌株中过表达铵盐利用相关基因对菌株氮源利用的影响

3．3．12 缺失Are1对纤维素酶的生产的影响

3．4 本章小结

第四章 里氏木霉类p53调控因子Vib1的功能分析

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 菌株、培养基及PCR引物

4．2．2 培养条件

4．2．3 用酶、试剂和试剂盒

4．2．4 主要实验仪器

4．2．5 常用试剂和缓冲液

4．2．6 分子生物学操作方法

4．2．7 突变菌株的构建

4．2．8 菌体生长分析

4．2．9 纤维素酶活力测定

4．2．10 生物信息学软件及分析

4．2．11 RNA的提取和检测

4．3．2 里氏木霉Vib1缺失菌株的构建

4．3．3 里氏木霉Vib1缺失菌株影响生长和蛋白酶的分泌

4．3．4 构建里氏木霉蛋白酶回补菌株和过表达菌株

4．3．5 Vib1参与里氏木霉在氮源饥饿条件下菌丝的自溶过程

4．3．6 Vib1缺失菌株纤维素酶活力丧失

4．3．7 Vib1调控纤维素酶基因的表达

4．3．8 Vib1缺失影响xyr1表达

4．3．9 Vib1缺失菌株过表达Xyr1对纤维素酶基表达的影响

4．3．10 RNA-seq揭示Vib1对里氏木霉纤维素酶合成的影响

4．3．11 Vib1缺失菌株过表达Crt1对纤维素酶基表达的影响

4．3．12 过表达vib1进行里氏木霉菌株改良

4．4 本章小结

第五章 里氏木霉高产纤维素酶突变菌株鉴定及其基因工程改良

5．1 引言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 菌株和质粒

5．2．2 PCR引物

5．2．3 培养条件、实验仪器和常用试剂

5．2．4 分子生物学操作方法

5．2．5 菌落形态和分子生物学鉴定

5．2．6 菌落及菌丝的形态观察

5．2．7 生长及碳源利用情况测定

5．2．9 里氏木霉SP4中过表达β-葡萄糖苷酶

5．2．10 纤维素酶活力测定

5．2．11 糖化不同预处理玉米芯底物

5．3 结果与讨论

5．3．1 分子和形态学鉴定纤维索酶高产菌株SN1

5．3．2 SN1纤维索酶分泌能力和糖化能力分析

5．3．3 构建里氏木霉SN1尿嘧啶营养缺陷型菌株

5．3．4 在SP4中本源过表达里氏木霉β-葡萄糖苷酶

5．3．5 里氏木霉中过表达β-葡萄糖苷酶对纤维素酶酶解效率的影响

5．3．6 过表达β-葡萄糖苷酶的里氏木霉纤维素酶系的糖化应用

5．4 本章小结

全文总结

参考文献

攻读学位论文期间已发表的学术论文

致谢

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摘要

植物生物质资源是地球上分布最广和储量最大的可再生资源。生物炼制能够将植物生物质转化为化学燃料等高附加值化学品，从而降低人类对化石能源的依赖。生物质炼制过程中，木质纤维素酶催化生物质生成可发酵糖是决定生物基化学品成本的关键因素，也是制约生物乙醇工业化和规模化的瓶颈。丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）是目前木质纤维素降解酶工业生产主要的菌株。由于其具有强大的蛋白分泌能力，也常作为异源蛋白表达的宿主菌株。虽然里氏木霉纤维素酶分泌水平能够超过40g/L，但高水平产酶条件下发酵后期纤维素酶的活力会显著降低，这是困扰酶制剂生产的共性问题，其原因可能与胞外蛋白酶的降解作用有关。另一方面，蛋白酶的存在能够给菌株的生长和蛋白质的合成提供大量氮源。因此，两种需求之间的矛盾促使我们对里氏木霉胞外蛋白酶和氮源利用展开研究。目前，该领域的研究在曲霉属和脉孢菌属中比较深入，但里氏木霉胞外蛋白酶与氮源利用的表达调控及其对纤维素酶生产的影响的研究还比较少。因此针对这些问题，我们本论文开展了以下的研究:
　　一、利用蛋白质组技术分离鉴定了12个里氏木霉蛋白酶，并对其进行敲除和功能分析。
　　里氏木霉在进行纤维素酶生产时，发酵后期，纤维素酶活力往往出现明显下降，这可能与胞外蛋白酶的降解作用有关。通过比较分析3d和7d的发酵液的蛋白质组成，我们共鉴定并基因敲除了12个蛋白酶。除蛋白ID为123244的蛋白酶敲除菌株不能够正常生孢，随后被鉴定为胞内蛋白酶外，其余的11个蛋白酶基因的敲除基本不影响菌株对氮源的利用。蛋白水解能力和蛋白酶活力分析发现，分别敲除蛋白酶Tr80170、Tr120998和Tr123234后，胞外蛋白酶活力明显降低，而其余9个蛋白酶基因的敲除对蛋白酶活力的影响不大。进一步以潮霉素抗性为筛选标记开展了多基因敲除研究，实现了对蛋白酶Tr80170、Tr120998和Tr123234同步敲除，构建了三个蛋白酶基因敲除的菌株ΔP57和ΔP70。脱脂奶粉平板和蛋白酶活力测定显示，三蛋白酶基因敲除菌株的蛋白水解能力显著降低。
　　二、鉴定里氏木霉氮源广域调控因子Are1，证明该因子在氮源代谢、孢子形成、蛋白酶分泌及纤维素酶表达中发挥重要功能。
　　为了研究里氏木霉胞外蛋白酶和氮源调控机制，首先分析了碳源和氮源对里氏木霉胞外蛋白酶产生的影响。脱脂奶粉平板分析发现，里氏木霉胞外蛋白酶的产生基本不受碳源的影响，而受氮源的影响较大，即胞外蛋白酶受到优先氮源（铵盐）的阻遏和次级氮源（如硝酸盐）诱导。接着，我们对里氏木霉氮源调控因子Are1展开了以下研究。鉴定了里氏木霉氮源调控因子Are1并构建了其缺失菌株，发现are1的敲除导致菌株不能够分泌胞外蛋白酶，且纤维素酶活力显著降低，主要纤维素酶基因cbh1、cbh2、eg1、eg2和bgl1的表达水平也显著降低。进一步对纤维素酶基因启动子区的Are1潜在结合位点（5'-HGATAR-3'，其中H代表A、T和C，R代表A或G）预测发现纤维素酶基因启动子上含有大量的Are1结合位点。因此，Are1可能直接调控了纤维素酶的表达。
　　里氏木霉are1的敲除导致菌株不能利用硝酸盐，这与其他丝状真菌Are1同源物的功能相似，但里氏木霉are1敲除菌株也不能利用铵盐，这与其他丝状真菌显著不同。表达谱测序发现，are1正向调控了里氏木霉铵盐代谢途径中相关基因的表达。are1敲除菌株中的铵盐通透酶基因mep1和mep2、谷氨酸脱氢酶基因gdh1、谷氨酰胺合成酶基因gs1的表达量显著降低。进一步，在are1敲除菌株中过表达mep1、mep2、gdh1和gs1，发现mep1、mep2和gdh1的过表达能够恢复are1敲除菌株对铵盐的利用，而gs1的过表达不能恢复铵盐的利用。上述结果说明，里氏木霉are1特异性地调控了里氏木霉对铵盐的利用。
　　因此，本论文的研究初步阐明了氮源调控因子are1调控了里氏木霉蛋白酶的合成和纤维素酶的表达，并发现are1能够调控铵盐和氨基酸的利用。这对于氮源调控因子Are1在丝状真菌中氮源调控功能的完善具有重要意义。
　　三、鉴定里氏木霉类p53调控因子Vib1，证明该因子在蛋白酶合成、菌体自溶及纤维索酶诱导信号的形成中发挥重要功能。
　　构巢曲霉胞外蛋白酶的表达不仅受到广域调控因子AreA的调控，而且还受到类p53调控因子XprG的调控。鉴于此，本论文对里氏木霉XprG的同源物vib1基因进行了系统的遗传功能分析。敲除vib1不仅导致菌株胞外蛋白酶活力显著降低，而且其纤维素酶分泌能力丧失。而vib1过表达菌株的FPA、EG、CBH、BGL活力和蛋白量分别增加170％、80％、77％、110％和40％。进一步分析Vib1缺失菌株的主要纤维素酶转录调控因子的表达量，发现纤维素酶转录激活因子xyr1的表达量显著降低，但在Vib1缺失菌株过表达xyr1不能够恢复纤维素酶分泌能力。这表明Vib1可能还通过其他途径调控纤维素酶的表达。表达谱数据分析发现，are1敲除菌株中纤维二糖转运蛋白Crt1的表达量显著降低。有文献报道里氏木霉Crt1的缺失导致菌株不能产生纤维素酶，并且xyr1的表达量也显著降低，这暗示了Vib1可能通过调控crt1的表达量继而调控纤维素酶的表达。
　　四、鉴定里氏木霉工业菌株SN1并遗传改良纤维素酶系。
　　本论文也鉴定了一株里氏木霉纤维素酶高产突变菌株SN1。纤维素酶活力分析发现，SN1具有较高的纤维素酶内切酶活力和较低的β-葡萄糖苷酶活力。然后，利用基因敲除策略构建了SN1的尿嘧啶营养缺陷型菌株SP4，建立了高效率的遗传转化体系。接着，本源过表达了β-葡萄糖苷酶。工程菌的BGL酶活力比出发菌株提高了17.1倍。改良的纤维素酶系成功用于高效降解不同预处理的玉米芯底物。本部分研究对里氏木霉工业菌株的遗传改良进行了有益探索，并为纤维素酶效率提升和纤维素转化成本降低提供了借鉴。

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