实时荧光定量PCR技术用于土壤中烟草青枯病菌的定量检测及动态分析

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烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草细菌性病害，主要发生在温度较高的热带、亚热带地区。近年来我国烟草青枯病菌发病地区逐步增加，在各大烟区均有发生，青枯病受环境因素影响较大，在部分年份爆发式发生，对烟叶的生产产生毁灭性打击，对我国的烟草农业产生极大危害。近几年来，由于气候等多方面的原因，该病逐步向北方烟区扩展，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。
　　烟草青枯病菌在土壤或者堆肥中越冬，不同条件下存活时间差异很大，烟草青枯病是高温高湿型病害，受温度和湿度影响很大。因此本实验探究在不同的环境条件下青枯病菌的生长繁育状况，以期探索青枯病青枯病菌的病原数量与青枯病发病率和病情指数之间的关系本研究利用实时荧光定量PCR技术，设计了两对烟草青枯病菌的特异性检测引物，在烟苗移栽后，对烟田中烟草青枯病菌的生物量进行定量检测，得到土壤中烟草青枯病菌的消长动态曲线。同时结合当地的气温和降水，分析了烟草青枯病的发病率及病情指数与病原菌种群数量之间的关系。主要研究结果如下：
　　1．设计并验证了引物的特异性。基于烟草青枯病菌flagellin(fliC) gene核苷酸序列保守区段，设计了烟草青枯病菌的特异性引物Flic-f1/Flic-r1、Flic-f2/Flic-r2，采用CTAB法提取烟草青枯病菌的DNA，利用常规的PCR扩增，得到200bp左右的两条目的片段。和从青枯病菌发病土壤中分离得到的其他病菌以及实验室培养的其他菌株DNA为模板进一步PCR检测。电泳结果显示只有烟草青枯病菌能够得到目的片段，其他菌株DNA均未得到目的片段，验证了所设计引物的特异性，后续实验采用Flic-f1/Flic-r1。
　　2．优化了常规PCR和Real-time PCR的反应条件，并检测了引物的灵敏度。在48℃-62℃之间分别在常规PCR和基于SYBR Green染料的Real-time PCR进行最适温度的优化，实验验证Flic-f1/Flic-r1在57.7℃得到最佳的PCR结果。10倍梯度稀释所提取的青枯病菌的标准DNA，经常规PCR和实时荧光定量PCR检验，结果显示常规PCR检测下限为1.0×10-4ng/μL，试试荧光定量PCR检测下限为1.0×10-5ng/μL。
　　3．绘制了Ct值与烟草青枯病菌DNA浓度对数的标准曲线。以提取的青枯病菌的标准DNA10倍浓度梯度稀释为模板，使用Bio-Rad-iQ5进行实时荧光定量PCR扩增。根据软件设置，得到标准曲线。结果显示，以ct值15-30为准，决定系数为0.998，扩增效率为99.6％，线性范围可达个6个数量级，溶解峰单一，无引物二聚体产生。实验证明该标准曲线能用于土壤中的烟草青枯病菌定量检测。
　　4．绘制田间烟草青枯病菌的病情指数变化曲线，探究了温度和降水对烟草青枯病菌的数量影响之间关系。在三地六点分别五点观测取样，记录了发病率，同时进行了病情指数的计算，并且利用荧光定量PCR技术测算土壤中的实时青枯菌量，结合当地气象站同步监测的气象资料，绘制了气象变化中降水和温度的变化曲线，结果显示在高温高湿条件下，烟草青枯病的发病率急速升高。根据实验观测结果三地六点的土壤菌含量与3d日均温均具有明显的相关性，但与3d降雨量相关性不明显。

著录项

作者
秦帅;
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作者单位

山东农业大学;

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授予单位山东农业大学;
学科植物保护
授予学位硕士
导师姓名徐后娟;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类植物病理学;烟草病虫害;
关键词
烟草青枯病菌; 实时荧光定量PCR; 气象变化; 定量检测;
入库时间 2022-08-17 11:04:20

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