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内镜下Fe3O4-MG7分子探针免疫染色用于早期胃癌诊断的基础与应用研究

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文献回顾

1.胃癌全球流行病学

2. 早期胃癌的定义

3. MG7单克隆抗体的研究进展

4. 分子影像学进展

第一部分 Fe3O4-MG7探针的制备与表征

1 材料

2方法

3 结果

4 讨论

第二部分Fe3O4-MG7探针细胞成像研究

1材料

2方法

3 结果

4讨论

第三部分 Fe3O4-MG7探针离体组织成像研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

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摘要

背景：
　　胃癌是比较常见的恶性肿瘤之一，其发病率占所有癌症的6.8％，肿瘤相关病死率占所有癌症的8.8%。由于早期胃癌发病隐匿，临床症状不明显，以及医疗水平和条件的局限，很多胃癌患者确诊时已处于中晚期，严重降低了患者的总生存率。而对于早期胃癌的患者，在内镜下或外科手术切除后，5年生存率高达92.6%，且可达到治愈的目的。因此，早期胃癌的诊断可以在很大程度上提高患者的总生存率，降低病死率。但是，目前我们仍缺乏可靠、准确的手段去满足临床的需求。MG7是本实验室制备的特异性单克隆抗体，能特异性识别胃癌细胞，与胃癌的发生发展有较好的相关性，对胃癌组织同样具有较高的特异性，其表达在萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生、胃癌的动态发展中不断增加。研究表明MG7-Ag是一种分泌性抗原，可以通过胃小凹分泌到胃液中，胃癌患者胃液中 MG7-Ag的检出率为81.1%，我们利用这一特点，拟以Fe3O4纳米颗粒为载体，与胃癌特异性抗体MG7构建Fe3O4-MG7分子探针。探针既可以特异性识别胃癌组织，又可以在普通内镜下实现肉眼可观察的免疫染色，其显色原理为Fe3O4可以和亚铁氰化钾显色液反应生成 Fe4[Fe(CN)6]3，称为普鲁士蓝。这在一定程度上克服了传统内镜检查的局限性，能直观的对病变进行定位，这一显像方式较其他探针诊断方式如荧光内镜、核磁共振显像都更加简单、直观，并且易于推广。
　　目的：
　　以表面包被有羧基的Fe3O4纳米颗粒为载体，构建具有一定靶向性的新型分子探针 Fe3O4-MG7。利用可直接在普通内镜下观察、低毒的免疫染色技术，在胃癌细胞及临床离体胃癌组织验证其成像能力，进而为在体临床试验的开展提供依据。以期建立利用分子探针及普通光学内镜技术结合的一种全新模式用于早期的胃癌诊断。
　　方法：
　　1. MG7抗体的制备与表达验证
　　（1）通过培养杂交瘤细胞，动物在体增殖，腹水收集、纯化获得MG7抗体。
　　（2）通过免疫荧光法检测MG7在SGC-7901细胞和GES细胞的表达及定位。
　　（3）通过免疫组织化学方法检测MG7在胃癌组织及癌旁正常组织中的表达。
　　2. Fe3O4-MG7探针的合成与表征
　　（1）通过EDC和sulfo-NHS活化Fe3O4纳米颗粒，再与MG7共价连接构成Fe3O4-MG7探针。
　　（2）通过动态光散射法检测Fe3O4-MG7探针的表面Zeta电位与水合粒径。
　　（3）通过XTT法检测Fe3O4-MG7探针的细胞毒性。
　　3.胃癌细胞探针成像的研究
　　（1）通过Fe3O4纳米颗粒与亚铁氰化钾反应生成普鲁士蓝。
　　（2）通过光镜下观察普鲁士蓝显色间接验证探针与肿瘤细胞的靶向结合能力与成像能力。
　　4.离体胃癌组织探针成像的研究
　　通过在胃镜下观察离体组织的显色验证探针与胃癌组织的靶向结合能力。
　　结果：
　　1. MG7抗体的制备与表达
　　（1）收集接种杂交瘤细胞的小鼠产生的腹水，纯化后获得了MG7抗体。
　　（2）MG7抗体在胃癌细胞SGC-7901与正常胃粘膜上皮细胞GES中表达存在差异，在SGC-7901细胞中表达，而在GES细胞中几乎不表达；
　　（3）在20例胃癌组织及其配对的癌旁正常组织中，免疫组化结果显示MG7在胃癌组织的表达率为85%，癌旁正常组织MG7不表达。
　　2. Fe3O4-MG7探针的合成与表征
　　探针合成后对探针的各种理化性质进行检测，结果显示：Fe3O4-MG7探针的水合尺寸为87.69±0.33nm，表面电位为-19.30±0.47mV。Fe的浓度在0-0.2mg/ml范围内时，并没有表现出明显的细胞毒性，当Fe的浓度达到0.2mg/ml时，细胞存活率为92.1%，浓度达到0.3mg/ml时，存活率下降到84.9%，而当Fe的浓度达到0.5mg/ml时，细胞的存活率只有53.4%。
　　3.胃癌细胞探针成像结果
　　用探针与SGC-7901细胞和GES细胞孵育后，加入PERK’S显色液显色，光镜下可见胃癌细胞系SGC-7901细胞中出现普鲁士蓝沉淀，而在正常胃粘膜上皮细胞G ES细胞中并未出现普鲁士蓝沉淀，证明了探针对胃癌细胞具有良好的靶向性。
　　4.离体胃癌组织成像结果
　　22例胃癌及癌旁正常组织离体标本中，18例胃癌组织在内镜下可以观察到普鲁士蓝显色，4例未显色，而癌旁正常组织均未显色。对照组在切取一部分癌组织用F e3O4纳米颗粒进行孵育后，22例胃癌离体标本均未显色。探针的特异性为100%，敏感性达到81.82%，证明探针对胃癌组织具有良好的靶向性。
　　结论：
　　我们利用 Fe3O4纳米颗粒与MG7单克隆抗体成功制备了分子探针Fe3O4-MG7。探针的理化性质检测结果显示探针的理化性质稳定，毒性相对较低。同时在细胞水平与离体组织中进行了成像能力验证，结果表明Fe3O4-MG7探针对胃癌细胞和胃癌组织具有良好的靶向性，并且具有较高的特异性与灵敏性。这一结果提示我们Fe3O4-MG7分子探针对于胃癌的诊断具有一定的临床意义，并且为将来在体应用免疫染色内镜下发现早期胃癌奠定了基础。

著录项

  • 作者

    李粉婷;

  • 作者单位

    中国人民解放军空军军医大学;

    第四军医大学;

  • 授予单位 中国人民解放军空军军医大学;第四军医大学;
  • 学科 临床医学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 王新;
  • 年度 2016
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 胃肿瘤;
  • 关键词

    分子探针; 纳米颗粒; 早期诊断; 分子影像; 胃癌;

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