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非黑素瘤性皮肤肿瘤中Beta-人乳头瘤病毒感染分析及机制探讨

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文献回顾

1β-HPV在皮肤良恶性增生性病变中的作用

1.1 HPV分类

1.2 HPV致癌机理

1.3 HPV的检测技术

1.4β-HPV、紫外线与NMSC

2 细胞自噬研究进展

2.1 细胞自噬

2.2 细胞自噬作用及分子机制

2.3 细胞自噬与病毒感染

2.4 细胞自噬与肿瘤

正文

1 实验材料与仪器

1.1 标本来源

1.2 主要试剂与仪器

2 实验方法

2.1 PCR检测β-HPV及α-HPV DNA

2.2β-HPV特异性分型

2.3 免疫组化

2.4 透射电镜

2.5 统计方法

3实验结果

3.1 NMSC 中HPV感染分析

3.2 HPV38感染组织中自噬水平检测

4 讨论

4.1 β-HPV在NMSC发病中的作用

4.2 HPV38增加细胞自噬在NMSC发病中的作用

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢

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摘要

非黑素瘤性皮肤肿瘤(nonmelanomaskincancer,NMSC)包括鳞状细胞癌(squamouscellcarcinoma,SCC)、基底细胞癌(basalcellcarcinoma,BCC)、光线性角化病(actinickeratosis,AK)、角化棘皮瘤等,是最常见的皮肤肿瘤,其中SCC是我国最常见的NMSC。随着生活方式和生活环境的改变,NMSC的发病率呈逐年上升趋势,由此产生的大量社会负担和医疗负担不容忽视。NMSC的发病与年龄、肤色、人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染、紫外线损伤、长期使用免疫抑制剂(如器官移植受者、艾滋病患者)等多种因素相关。其中HPV感染、紫外线损伤是其发病的主要危险因素。HPV是一类小的双链闭环DNA病毒,与许多疾病的发生相关,迄今已发现约130种HPV亚型,并将其归为16个种属(如α、β、γ、u-HPV等)。目前已经明确α-HPV可导致宫颈癌发生,而β-HPV与NMSC密切相关。然而,尽管β-HPV是NMSC发生重要危险因素,是否也存在致病的高危亚型,其致病机理如何,目前仍不清楚。
　　与α-HPV不同,β-HPV的致病机制研究刚刚起步,目前多认为β-HPV与紫外线联合导致NMSC的发生。肿瘤的发生与多种因素相关,病毒感染是肿瘤发生的重要生物因素,然而病毒感染导致肿瘤发生的机制尚不清楚。细胞自噬是Ⅱ型程序性死亡,广泛存在于真核细胞。正常情况下,自噬发挥着“清道夫”的作用,吞噬、降解受损的细胞器和病原微生物,是一种重要的防御和保护机制。细胞自噬异常与肿瘤的发生、发展密切相关,在肿瘤进展的不同阶段,细胞自噬发挥的效应也不同。在肿瘤早期,细胞自噬可能发挥着抑癌的作用,在肿瘤后期则可能会促进癌症的发生。如何积极利用细胞自噬抑制癌细胞增殖的功能,最大程度遏制其促癌效应是未来研究的重中之重。
　　本研究检测192例NMSC及80例正常对照新鲜组织中β-HPVDNA,旨在了解我国西北地区NMSC中β-HPV感染情况,并通过进一步对阳性标本进行β-HPV分型以明确可能致病的高危亚型;通过免疫组化检测NMSC中自噬水平变化及相关信号通路改变,初步探讨β-HPV感染引起的细胞自噬在NMSC中的致病机理。
　　实验目的:
　　1.了解我国西北地区NMSC中β-HPV流行现状。
　　2.明确在NMSC中具有关键致癌作用的β-HPV亚型。
　　3.初步探讨细胞自噬在β-HPV感染与NMSC发病中的作用。
　　实验方法:
　　首先,我们收集经病理确诊的192例NMSC及80例正常对照新鲜组织,通过巢式PCR检测NMSC中β-HPVDNA,PCR检测α-HPVDNA,并采用巢式PCR的方法比较石蜡组织中β-HPV感染率;其次,我们应用特异型PCR引物对筛选出的阳性标本进行β-HPV分型;经统计分析得出可能具有关键致癌作用的β-HPV亚型,利用免疫组织化学技术观察HPV感染后AK与SCC自噬水平及相关信号通路的改变;最后,采用透射电镜观察NMSC中自噬水平的变化。
　　实验结果:
　　1.分析我国西北地区NMSC中β-HPV流行现状:采用巢式PCR检测NMSC新鲜组织中β-HVPDNA结果表明,50例AK、20例SCC、50例BCC、72例脂溢性角化病(seborrheickeratosis,SK)、80例正常对照中β-HPV阳性率分别为80％、75%、44%、21%和35%。经统计分析,AK和SCC中β-HPV阳性率远高于对照组,P<0.05,ORAK=8.75,ORSCC=5.469。而SK、BCC检出率较对照相比,差异无统计学意义。不同来源正常皮肤中,来自AK、SCC对照中β-HPV阳性率较健康对照组织明显增高,结果有统计学意义。AK、SCC、BCC、SK与自身对照β-HPV检测结果显示,AK、SCC周围正常皮肤中β-HPV阳性率显著高于其他病例组。
　　2.NMSC中α-HPV感染分析:α-HPVDNA检测结果显示,无论是AK、SCC、SK、BCC还是正常对照,α-HPV阳性率均较低,差异无统计学意义;α-HPV与β-HPV混合感染AK1例、SCC1例、对照组2例。SK与BCC无混合感染。
　　3.石蜡组织中β-HPV感染分析:同样采用巢式PCR法检测AK和SCC石蜡组织中β-HPVDNA,阳性率AK62.5%(15/24),SCC44%(11/25),正常对照8.3%(1/12),AK和SCC中β-HPV检出率较对照明显增高,但是与新鲜组织相比β-HPV阳性率均较低。
　　4.β-HPV特异性分型:利用12种β-HPV(HPV5、8、15、17、19、20、21、23、36、38、49、80)特异性PCR引物对阳性标本进一步分型,结果显示:在AK和SCC中,HPV38检出率最高,其中,15例SCC中β-HPV38阳性者为12例(80%),40例AK中阳性者25例(62.5%)。而在SK及正常皮肤中以上12种HPV检出率均较低。
　　5.免疫组化分析NMSC中自噬变化:免疫组化结果显示,与正常对照(HPV+/HPV-)相比,HPV感染后各病例组(HPV38+/HPV38-)LC3、Beclin1表达均增高,特别是在HPV38+SCC组阳性着色细胞最多,颜色最深(P<0.001),自噬水平明显升高;p62在正常皮肤中呈弱阳性表达,在SCC中无明显阳性着色(P<0.05)。
　　6.免疫组化分析NMSC中PKR信号通路:与对照组相比,HPV感染后(HPV38+/HPV38-),各病例组PKR、p-PKR、eIf2α、p-eIf2α表达均增高(P<0.05),尤其HPV38+AK组p-PKR、p-eIf2α表达明显高,而SCC较对照组无显著差异。
　　7.透射电镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)观察NMSC自噬超微结构:HPV38+SCC组织中自噬小体数目明显多于AK和正常对照组(P<0.001),该结果与免疫组化一致。
　　主要结论:
　　1.β-HPV在AK和SCC中检出率远高于对照组,提示β-HPV与AK、SCC的发生,发展密切相关。
　　2.HPV38是与AK、SCC发生密切相关的主要亚型。
　　3.AK、SCC中细胞自噬水平升高,提示:一方面,在SCC发生早期阶段(即癌前病变AK),自噬水平增高可清除受损的细胞器维持基因组稳定性发挥抑癌作用;另一方面,在SCC进展期,过度诱导自噬可为细胞转化提供营养和能量,促进癌细胞在恶劣环境下生存、增殖。
　　4.HPV38可能通过激活PKR-eIf2α信号通路诱导自噬水平增高。

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