CD34+人造血干细胞(hHSC)HIV-1辅受体的表型剔除对病毒感染的阻断作用

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艾滋病（AIDS）从发现至今已有25年，但它在全球所引起的广泛流行，已使4000多万人受到感染，2200多万人失去了生命。目前全球人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者总数达到4200万人，如果不扩大采取有效预防措施，在2010年前，世界126个中、低收入国家还将有4500万人感染HIV，其中40％在亚洲和太平洋地区。中国和印度这两个人口最多的国家HIV/AIDS也在蔓延：中国HIV感染者总数已近100万人，如果不能有效控制，今后10年这一数字可能会成倍增加；印度HIV感染者更是达到了397万，而且今后仍有可能大幅增长。目前应用联合高效的抗逆转录病毒疗法（HAART），已在很大程度上降低了HIV-1感染的发病率和死亡率。三类主要的药物——核苷类逆转录酶抑制剂（NRTI）、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)和蛋白酶抑制剂（PI），它们定向作用于逆转录酶和蛋白酶。尽管这些药物可以有效地抑制病毒感染，但由于抗药性HIV-1的出现，以及抗逆转录病毒治疗中出现的许多不良反应，目前仍迫切需要研发新的治疗药物和方法。
　　在各种新的正在研发的抗HIV药物中，趋化因子受体拮抗剂最令人注目，这不仅因为它能够有效地对抗逆转录病毒活性，还能靶向性阻断HIV-1入侵细胞的关键蛋白——CD4＋T细胞和巨噬细胞表面的微孔蛋白（即HIV-1辅受体），可以阻断其与病毒包膜糖蛋白（gp120）间的相互作用，从而发挥抗HIV-1感染的治疗作用。因此，关于HIV-1辅受体及其配体——趋化因子RANTES、MIP-1和SDF-1的研究，成为抗HIV-1感染基因治疗基础研究的热点内容。
　　美国ChenSY领导的科研小组研究表明：α类趋化因子SDF-1的细胞内表达可以从表型上剔除CXCR4，从而阻断T嗜性HIV-1的感染；而β类趋化因子RANTES和MIP-1的细胞内表达可以从表型上剔除CCR5，从而阻断M嗜性HIV-1的感染。我科白雪帆教授、张颖博士等在单一配基表达阻断HIV-1研究的基础上，采用细胞内趋化因子（intrakine）技术构建含有HIV-1两类辅受体的配体——趋化因子RANTES和SDF-1的双表达真核载体和逆转录病毒载体；将表达载体转染各类细胞，观察目的基因的表达及表达产物在细胞内与辅受体的结合；病毒感染实验检测辅受体表型剔除对HIV-1膜蛋白诱导合胞体形成、假病毒HIV-CAT的表达及病毒p24抗原活性，观察了淋巴细胞辅受体的表型剔除对HIV-1病毒感染的阻断作用。
　　在基础和应用研究中，作为基因转移的一种新的有效和多用途的工具，慢病毒载体在基因治疗领域展示出可喜的前景。慢病毒载体能转导非分裂细胞，并能维持转基因持久和长期表达。许多细胞类型，如脑、肝、肌肉和造血干细胞，已经成功地转导了携带多种基因的慢病毒载体。同样，慢病毒载体能设计成可表达治疗性抗HIV-1的基因，特异性地靶向于病毒复制的不同阶段。为此，我们应用分子生物学技术构建了含CC-细胞内趋化因子（CC-intrakine，RANTES-K）和CXC-细胞内趋化因子（CXC-intrakine，SDF-K）的慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K，并在293FT细胞中建立了慢病毒株，转导CD34＋人造血干细胞（hHSC）后，观测了细胞中RANTES和SDF-1蛋白的表达情况及感染HIV-1病毒液后p24抗原分泌水平，以观察CD34＋hHSC辅受体的表型剔除对HIV-1病毒感染的阻断作用。
　　实验结果如下：
　　1、酶切和测序表明HIV-1辅受体CCR5、CXCR4的配体RANTES和SDF-1的慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K符合其物理图谱，构建是成功的。
　　2、在293FT细胞中分别制备了包含慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K的慢病毒株，滴度分别为8.67×105转导单位（TU）/ml和8.56×105转导单位（TU）/ml，此慢病毒株可用于后续研究。
　　3、将慢病毒株分别转染HeLa细胞和免疫磁珠法分离人脐带血得到的CD34＋hHSC(流式细胞仪分析纯度为96.8％)，间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1蛋白可以表达于人宫颈癌HeLa细胞系和CD34＋hHSC内。
　　4、慢病毒株转染的CD34＋hHSC在感染HIV-1DP1/27病毒液后第4、7和10d皆可发现显著的p24抗原表达下降（P<0.05），分别减少了51％、58％、60％（包含慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K的慢病毒株）和50％、57％、58％（包含慢病毒表达质粒pLenti6/V5-S-K的慢病毒株），表明慢病毒表达质粒pLenti6/V5-R-K和pLenti6/V5-S-K转染具有阻断HIV-1病毒复制的作用。
　　综上所述，本文采用细胞内趋化因子技术进行HIV-1两类主要辅受体CCR5和CXCR4的配体——RANTES和SDF-1的慢病毒质粒表达，使两类HIV-1辅受体被阻断，并转染到CD34＋人造血干细胞（hHSC）中，试图为将来回输基因修饰的hHSC进而永久抑制HIV-1复制的抗HIV-1基因治疗寻求一个新的突破点。

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作者
孙利;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科内科学(传染病)
授予学位博士
导师姓名白雪帆;
年度 2008
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类获得性免疫缺陷综合征（AIDS艾滋病）;
关键词
CD34＋人造血干细胞; 人类免疫缺陷病毒; 表型剔除; 抗逆转录病毒疗法; 阻断作用; 病毒感染;

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