• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >利用O-糖基化生产志贺氏菌多糖结合疫苗
【6h】

利用O-糖基化生产志贺氏菌多糖结合疫苗

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

声明

缩略词表

第一章 前 言

1.0 引言

1.1细菌表面多糖

1.2细菌蛋白糖基化系统

1.3细菌多糖疫苗与多糖结合疫苗

1.4 志贺氏菌

1.5 在军事医学中的意义

第二章 利用O-糖基化系统制备细菌多糖结合疫苗体系的建立

2.0 引言

2.1材料与方法

2.2 结果与分析

2.3讨论

2.4 小结

第三章 O-糖基化修饰位点结构域优化及应用

3.0 引言

3.1材料与方法

3.2 氨基酸表述

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 小结

参考文献

附录

个人简历

致谢

展开▼

摘要

细菌表面多糖（如脂多糖、荚膜多糖等）能够刺激机体产生保护性的抗体，因此可以用来制备多糖疫苗，然而由于多糖为 T细胞非依赖抗原，在免疫过程中并没有 T细胞参与，因此无法产生高亲和力的抗体和免疫记忆，同时由于婴幼儿免疫系统尚未发育完善，故这种疫苗对2岁以下婴幼儿几乎无效。之后人们发现当细菌表面多糖与适当的载体蛋白相连，会形成糖蛋白，能够大大的提高多糖的免疫原性。多糖结合疫苗是将多糖共价连接到载体蛋白，由于底物蛋白的存在，使单独的多糖（T细胞非依赖抗原）转换为了T细胞依赖抗原，在免疫过程中多糖在蛋白多肽的辅助下可被MHC-II分子识别并提呈到T细胞，从而促进T细胞分化，激发体液免疫，产生高亲和力的抗体和免疫记忆。目前的多糖结合疫苗在市场上占有很高的份额，其中上市的疫苗产品主要是利用化学法生产，这种方法是将蛋白和糖分别提取并纯化，再通过化学交联后再次纯化。由于需要多次纯化，收率较低，提高了生产成本，故这种方法生产的多糖结合疫苗大多在发达国家使用，很难在发展中国家及贫穷国家普及。
　　随着合成生物学的发展以及细菌蛋白糖基化的发现，使得利用生物法生产多糖结合疫苗成为了可能。人们发现细菌脂多糖合成与细菌蛋白糖基化在合成路径上具有很大的相似性，产生的多糖都是在相应的酶的催化下，从脂载体转移到适当的载体，而区别主要在于转移所需的酶和最终的载体不同，脂多糖合成是 O-抗原连接酶催化，转移到脂质 A核心；而蛋白糖基化是糖基转移酶催化多糖转移到底物蛋白。因此可以利用这种相似性，通过将其中的部分原件替换，就可以直接在生物体内生产多糖结合疫苗。目前研究较为透彻的细菌糖基化系统有两种，一种是来自空肠弯曲杆菌的N-糖基化系统，由糖基转移酶PglB催化；另一种为来自脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化系统，糖基转移酶为PglL。这两种糖基转移酶均可以转移到大肠杆菌中并独立地完成催化反应。由于PglB糖基化位点已经明确(D/E-X1-N-X2-S/T)，所以国外已利用细菌 N-糖基化系统生产痢疾志贺氏菌多糖结合疫苗，并完成了I期临床实验，表现出了很好的安全性和有效性。但由于N-糖基化系统中的糖基转移酶PglB催化的多糖需要满足一定的条件，同时许多病原菌中多糖合成基因簇的不明确而导致无法构建其表达载体，这些均限制了这种方法的发展。
　　本文介绍了另一种糖基化修饰系统——来自脑膜炎奈瑟球菌的O-糖基化系统，其中糖基转移酶PglL具有非常宽松的底物特异性，无类似PglB对糖结构和类型的限制，几乎可以催化所有的糖。首先，通过直接将外源的O-糖基转移酶PglL及其天然底物蛋白 PilE的表达载体转入 O-抗原连接酶缺失的志贺氏菌301DWP中，能够有效地催化志贺氏菌中自身合成的多糖转移到底物蛋白 PilE的糖基化位点，使其发生糖基化修饰。由于PglL糖基化位点保守的序列至今仍不明确，我们随后通过将天然底物蛋白中糖基位点（第63位丝氨酸）周围29个氨基酸组成的序列(45SAVTEYYLNHGEWPGNNTSAGVATSSEIK73)与疫苗研究及市场上常用的载体蛋白（如rEPA、TTc及CTB）进行融合，通过蛋白免疫印迹（WB）检测，同样能够获得较高的糖基化水平；其次，为了实现可控的糖蛋白比，我们在这些底物蛋白的N-端和C-端分别融合糖基化位点序列，并检测这些糖基化位点是否依然能够发生有效的糖基化，结果表明当底物蛋白融合两个糖基化位点时，WB结果中可以检测到两个集中的糖基化条带，其中分子量较大的为两个位点同时被糖基化修饰时的糖蛋白；进一步，为了检测这套糖基化系统的普遍适用性，我们将这套糖基化系统转入甲型副伤寒沙门氏菌中。由于甲型副伤寒沙门氏菌中 O-抗原多糖还原端第一位多糖并没有乙酰化修饰，因此不能被PglB识别。而当我们分别将以rEPA和CTB为底物蛋白的O-糖基化系统转入其中时，可以检测到底物蛋白成功地被糖基化；接下来，通过亲和层析、离子交换及分子筛对糖蛋白进行了纯化，通过高效液相色谱法检测样品纯度，通过 BCA法及硫酸蒽酮法分别检测样品中蛋白和多糖的浓度，结果表明我们得到了具有较高纯度的糖蛋白，rEPA4573-OPS和 CTB4573-OPS的纯度分别达到了99.7％和93.2%。最后，将不同底物蛋白的糖蛋白三次免疫小鼠，末次免疫后10天取血检测血清中特异性抗体的效价，发现在抗体亚型中IgG1占主导，表明主要激发了体液免疫，并且CTB为底物蛋白时免疫效果最好。为了检测抗体激活的经典补体途径，我们又进行了体外杀菌实验，表明抗体能够与菌体形成抗原抗体复合物，可激活经典的补体途径杀死细菌。同时为了检测保护效果，对末次免疫后14天的小鼠进行攻毒实验，发现CTB作为底物蛋白时具有很好的保护效果，保护率超过了70%。
　　在上述基础上我们进一步对糖基转移酶 PglL的O-糖基化位点进行了研究。之前我们选取的糖基化位点序列为PilE糖基化位点周围29个氨基酸，为了进一步明确 O-糖基化位点序列，我们将糖基化位点序列缩短并优化，同时利用 WB检测糖基化水平，通过在原始的糖基化位点序列两端加入疏水序列，最终将原始的29个氨基酸缩短为10个氨基酸。之后通过丙氨酸扫描以及氨基酸同源性分析，对其中每个氨基酸对糖基化的贡献进了研究，发现其中两个氨基酸较为保守。随后，对非保守的氨基酸进一步的突变和简化，得到较短的糖基化位点序列，接下来，我们在所得的序列 C-端引入刚性氨基酸脯氨酸，从而避免后续氨基酸序列对糖基化的影响。最终我们得到了PglL催化的O-糖基化修饰位点的共有序列为WPXnSXmP，其中Xn和Xm为可变的柔性氨基酸，而最优的序列为WPAAASAP，并命名为 MOOR。在此基础上我们对疫苗进行了更加精细的设计，首先将糖基化位点周围的亲水性氨基酸替换为不同提呈能力的多肽，以提高糖肽的提呈能力，之后通过动物实验进行验证表明糖基化位点周围不同的多肽可以影响最终的免疫效果，为下一代多糖结合疫苗的精确设计打下了基础。
　　目前尚未有利用 O-糖基化生产多糖结合疫苗的报道，我们的研究首次利用O-糖基化生产多糖结合疫苗，并取得了成功，同时我们提供了一种针对不同病原菌更为简单方便的生产策略。这种系统中糖基转移酶PglL能够在不同病原菌中发挥功能，可识别不同的多糖，使不同的底物蛋白发生糖基化，表明了这套系统的普遍适用性，可生产不同细菌的多糖结合疫苗。我们在原有的29个氨基酸序列的基础上，通过一系列的突变，寻找到了一种PglL可识别的保守的氨基酸序列，只包含8个甚至更少的氨基酸。与化学法相比较，生物法生产的多糖结合疫苗更加精细、可控，产品具有很好的均一性。我们使用 O-糖基化制备多糖结合疫苗的方法扩展了糖工程在多糖结合疫苗研究的手段，为生产多糖结合疫苗开辟了新的途径。在未来的研究中，载体蛋白可以进一步的优化，选择较大的纳米颗粒提高免疫原性或者选用细菌本身具有较强免疫原性的蛋白作为底物蛋白从而提供双重的保护。

著录项

  • 作者

    潘超;

  • 作者单位

    解放军军事医学科学院;

    中国人民解放军军事医学科学院;

  • 授予单位 解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院;
  • 学科 微生物学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 王恒樑;
  • 年度 2016
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 免疫血清学;
  • 关键词

    O-糖基化; 多糖结合疫苗; 修饰位点; 志贺氏菌;

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号