α-黑素细胞刺激素基因原位转染及B7-H1基因修饰的树突状细胞对小鼠同种异体心脏移植排斥反应的影响

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移植排斥反应是器官移植成功的主要障碍之一，T淋巴细胞和细胞因子在急性排斥反应中所起的核心作用已经被公认。现有的免疫抑制剂如环孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)在抑制排斥反应的同时也使机体免疫系统被全面抑制，且不能彻底地解决移植排斥的问题。因此，诱导机体对移植抗原选择性的无反应，是目前移植免疫领域研究的热点。α-黑素细胞刺激素(α-melanocytestimulatinghormone，α-MSH)是近几年来发现的具有抗多种急、慢性炎症作用的内源性神经免疫调节肽。它能抑制促炎细胞因子(IL-1、TNF-α、IL-6、MIF等)、趋化因子(IL-8，MCP-1等)、一氧化氮合酶和NO等多种致炎症因子的产生和作用，但却诱导单核细胞产生抑制性细胞因子IL-10。α-MSH还能下调单核/巨噬细胞、血管内皮细胞表达粘附分子，抑制T细胞的增殖、并抑制其分泌IL-2和表达CD3、CD25、CD28分子，所以α-MSH具有很强的免疫调节作用。此外，α-MSH是人体内存在的小分子调节肽，无抗原性，在体内代谢较快，目前尚未发现有任何蓄积毒性。树突状细胞(dendriticcells，DC)作为一类功能最强的专职抗原递呈细胞(APC)，是唯一能够激活初始型T细胞的APC，在识别和递呈抗原、启动免疫应答、诱导急性移植排斥反应中起关键作用，不仅被认为是免疫应答的启动和调节者，在同种异体移植排斥反应中也可以作为治疗的有力工具。非成熟型DC显示出较强的致耐受活性，由于DC持续性表达MHC抗原，进入受者淋巴组织的T细胞依赖区域，并选择性的与宿主T细胞相互作用，抑制T细胞免疫活性，从而延长同种异体移植物存活时间；但是这种活性随着DC的成熟转变为免疫原性。因此免疫抑制基因如CTLA4-Ig、TGF-β、vIL-10可以成功导入非成熟型DC并诱导T细胞免疫低反应状态。根据上述理论，以AAV为载体，将α-MSH基因经主动脉灌注原位转染供者小鼠心脏，再行同种异体心脏移植，可能成为预防和治疗移植排斥反应的更有效的手段。另一方面，以Ad为载体，将B7-H1基因转入供者小鼠骨髓来源的非成熟DC(B7-H1-DC)，使DC高表达B7-H1，可能会抑制T细胞增殖；再将B7-H1-DC回输至受者小鼠体内，使其作用于T细胞、单核/巨噬细胞及血管内皮细胞，亦可能预防和治疗移植排斥反应。因此，我们选择α-MSH基因为目的基因，AAV为载体，研究携带α-MSH基因的AAV载体经主动脉灌注原位转染供者小鼠心脏，再行同种异体心脏移植，对同种异基因移植物存活时间的影响和机制；另一方面，选择B7-H1基因为目的基因，以Ad为载体，研究携带B7-H1基因的Ad载体转染后的DC(B7-H1-DC)表型和功能变化，通过小鼠血管化的同种异基因异位心脏移植模型，观察B7-H1-DC在体内对同种异基因移植物存活时间的影响和机制。目前尚未见相同研究报道。第一部分α-MSH基因经主动脉灌注原位转染供者小鼠心脏对同种异体移植排斥反应的影响首先用pAAV-RC和pHelper加上pAAV-IL-6sp-α-MSH或pAAV-IRES-hrGFP共转染AAV-293病毒包装细胞，分别包装携带α-MSH基因和绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV-α-MSH)和单纯携带GFP的重组腺相关病毒(rAAV-GFP)，并将其纯化。用两种重组腺相关病毒或PBS经主动脉灌注原位转染供者小鼠心脏，再行同种异体心脏移植，研究对移植物存活时间的影响及相关机制。将BALB/c小鼠随机分为4组，每组10只，作为供者。将C57BL/6小鼠随机分为4组，每组10只，作为受者。获取BALB/c小鼠心脏，置于0～4℃林格氏液中修整，以1mlPBS或1ml重组腺相关病毒(rAAV-α-MSH)或单纯携带GFP的重组腺相关病毒(rAAV-GFP)分别经主动脉灌注转染心脏1小时，然后将其移植给C57BL/6小鼠。观察各组心脏移植物的存活期，测定移植心脏原位的α-MSH表达情况，术后7天观察心脏移植物的病理改变，并测定移植心脏原位的细胞因子水平。结果显示，腺相关病毒载体能有效地将α-MSH基因导入小鼠心脏，rAAV-α-MSH经主动脉灌注原位转染供者小鼠心脏明显延长心脏移植物平均存活时间。第二部分B7-H1基因修饰的小鼠骨髓来源的树突状细胞对同种异体小鼠心脏移植排斥反应的影响第二部分实验中，扩增小鼠的B7-H1基因，构建携带B7-H1基因和GFP基因的重组腺病毒(rAd-B7-H1)及单纯携带GFP的重组腺病毒(rAd-GFP)，并将其纯化。用GM-CSF和IL-4在体外扩增BALB/c小鼠骨髓来源的DC，在培养的第四天，用两种重组腺病毒分别转染未成熟DC，制备B7-H1基因和GFP基因修饰的DC(B7-H1-DC)以及单纯GFP基因修饰的DC(GFP-DC)，然后在荧光显微镜下观察Ad转染DC的效率，用流式细胞仪检测B7-H1-DC表达B7-H1的情况。结果显示：用rAd-B7-H1转染DC，12h后就可以在荧光显微镜下观察到GFP的表达，随时间延长逐渐增多至48h达到高峰，转染效率为60％；以上结果表明，腺病毒载体能有效地将B7-H1基因导入未成熟DC。

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作者
张莉;
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作者单位

第二军医大学;

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授予单位第二军医大学;
学科免疫学
授予学位硕士
导师姓名田野苹;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类医用实验动物学;心脏疾病;心脏;
关键词
α-黑素细胞刺激素; B7-H1基因; 树突状细胞; 心脏移植; 神经免疫调节肽; 免疫抑制剂;

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