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NALP1炎症小体在大鼠神经痛及痛情绪中的作用及电针缓解痛情绪作用观察

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摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 试剂

1．3 仪器

2 实验方法

2．1 神经痛大鼠模型的制备

2．2 神经痛大鼠痛觉行为评价

2．3 神经痛大鼠情绪行为评价

2．4 神经痛大鼠运动行为评价

2．5 电针穴位和方法

2．6 给药途径和药物配制

2．7 组织切片制备

2．8 荧光免疫组织化学

2．9 组织蛋白的提取

2．10 酶联免疫吸附实验(ELISA)

2．11 蛋白印迹实验(Western Blot)

2．12 免疫沉淀反应(IP)

2．13 数据统计和分析

2．14 有关溶液配制

结果

第一部分 脊髓NALP1炎症小体在大鼠神经痛中的作用

1．神经痛大鼠机械性痛觉超敏以及热痛觉过敏行为学变化

2．神经痛大鼠脊髓NALP1炎症小体的激活及细胞定位

3．抑制炎症小体产物caspase-1对大鼠神经痛的影响

4．脂氧素类似物ATL对神经痛大鼠脊髓NALP1炎症小体的作用

第二部分 海马NALP1炎症小体在大鼠痛情绪中的作用

1．神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的评价

2．神经痛大鼠海马NALP1炎症小体的激活及细胞定位

3．抑制炎症小体产物caspase-1对大鼠痛情绪的影响

第三部分 电针对神经痛大鼠的作用观察

1．电针对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的作用

2．电针对神经痛大鼠热痛觉过敏的作用

讨论

结论

参考文献

在读期间发表论文

综述一 NALP1炎症小体在中枢神经系统疾病中的研究进展

综述二 脂氧素在神经系统疾病中的保护作用

致谢

声明

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摘要

本论文拟在神经痛模型上，采用行为学、分子生物学等技术开展以下研究:(1)观察神经痛大鼠脊髓背角中NALP1炎症小体的激活及细胞定位，并评价其对神经痛大鼠痛行为的影响;(2)观察神经痛大鼠海马中NALP1炎症小体的激活及其对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的影响;(3)观察多次电针治疗对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的影响。
　　实验结果如下:
　　第一部分 脊髓NALP1炎症小体在大鼠神经痛中的作用
　　模型大鼠术侧后肢的机械痛阈和热痛阈显著降低，证实神经痛大鼠模型制备成功。在神经痛大鼠脊髓中，NALP1炎症小体被显著激活，鞘内连续给予成熟caspase-1抑制剂可以有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏。激活的炎症小体在脊髓背角浅层主要表达于星形胶质细胞，部分位于神经元。鞘内多次给予抗炎分子ATL可以显著抑制神经痛大鼠脊髓内NALP1炎症小体的激活并有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏。
　　第二部分 海马NALP1炎症小体在大鼠痛情绪中的作用
　　1.神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的评价
　　将大鼠随机分为三组:正常组(Normal)、假手术组(Sham)和模型组(Model)，每组10只。分别采用强迫游泳实验和高架十字迷宫实验对大鼠抑郁样行为和焦虑样行为进行评价。强迫游泳结果显示，与正常组和假手术组相比，神经痛大鼠在造模后第7天游泳静止时间显著延长，挣扎时间显著缩短，表现出显著的绝望行为(behavioral despair)，并持续至术后21天。高架十字迷宫实验结果显示，在神经痛术后第7天和术后21天，模型组大鼠的开臂进入次数百分比和开臂停留时间百分比均显著下降，表现出焦虑样行为。此外，在上述实验同一时间点，采用旷场实验对神经痛大鼠的自发运动进行评价。结果显示，与正常组和假手术组相比，神经痛大鼠在旷场中的自发水平运动和直立运动均无显著差异。
　　2.神经痛大鼠海马NALP1炎症小体的激活及细胞定位
　　2.1.神经痛大鼠海马中NALP1炎症小体的激活情况
　　将SD大鼠随机分为三组:正常组(Normal)、假手术组(Sham)和模型组(Model)。假手术组与模型组分别在术后第3、7、21天新鲜取材海马组织，采用ELISA、Western blot及IP的实验方法观察不同时间点神经痛大鼠海马中成熟IL-1β、成熟caspase-1的表达变化以及炎症小体的激活情况。Western blot等结果显示，与正常组和假手术组相比，模型组大鼠对侧海马中成熟IL-1β在术后第7天显著升高。而海马中成熟caspase-1在术后第7天也明显升高，并持续至术后第21天。IP结果显示，在神经痛术后第7天至术后第21天，模型组大鼠海马内炎症小体各组份大量聚集，NALP1炎症小体被激活。上述结果中假手术组在各时间点与正常组均无显著差异。
　　2.2.神经痛大鼠海马中NALP1炎症小体的细胞定位
　　采用免疫荧光双标结合激光共聚焦扫描的方法观察caspase-1在海马CA1、CA3、DG区的神经细胞分布情况。将大鼠随机分为两组:正常组(Normal)及模型组(Model)，于术后第21天灌流固定取材。结果显示，在神经痛大鼠海马中，caspase-1（前体+成熟）分子在主要分布于神经元，部分分布于星形胶质细胞，而与小胶质细胞不共标。
　　3.抑制炎症小体产物caspase-1对大鼠痛情绪的影响
　　为了进一步证明海马NALP1炎症小体对神经痛诱发抑郁及焦虑样行为的作用，将神经痛大鼠随机分为两组:10％ DMSO对照组和YVAD（10 nmol/只）组，在神经痛大鼠术后第7天至术后第21天，海马连续给予成熟caspase-1抑制剂YVAD10 nmol，术后第21天采用行为学及分子生物学方法观察YVAD对神经痛大鼠抑郁和焦虑样行为及海马内成熟IL-1β作用。行为学实验结果显示，在强迫游泳实验中，海马连续给予YVAD可显著缩短神经痛大鼠的游泳静止时间，并提高其游泳挣扎时间。但在高架十字迷宫实验中，YVAD10 nmol对神经痛大鼠的焦虑样行为没有影响。各组大鼠在行为学测试后新鲜取材行ELISA实验。结果显示，与正常组相比，神经痛大鼠脊髓内成熟IL-1β水平升高，而YVAD多次给药后可显著抑制模型大鼠海马内成熟IL-1β生成。
　　小结:神经痛大鼠在术后第7天即出现抑郁样行为与焦虑样行为，并可持续至术后21天。在神经痛大鼠术后第7天，海马中NALP1炎症小体被大量激活，其产物成熟caspase-1、成熟IL-1β显著升高。抑制海马内成熟caspase-1可以显著缓解神经痛大鼠抑郁样行为。
　　第三部分 电针对神经痛大鼠痛情绪的作用观察
　　为了寻求对痛情绪的有效治疗手段，本实验采用行为学实验方法评价了多次电针对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的影响，并将其作用与抗抑郁药氟西汀进行了初步比较。
　　1.电针对神经痛大鼠抑郁样及焦虑样行为的作用
　　分别采用强迫游泳实验和高架十字迷宫实验对神经痛大鼠电针治疗前后的抑郁样行为和焦虑样行为进行评价。将大鼠随机分为:正常组、模型组、模型+假针组、模型+电针组。假针组与电针组在术后第7天至术后21天分别接受针刺与电针治疗，隔天一次，选穴均为头顶部“百会”穴与手术对侧下肢的“阳陵泉”穴。与此同时，将大鼠随机分为:正常组、模型组+生理盐水组、模型+氟西汀10 mg/kg组和模型+氟西汀30 mg/kg组，每日对神经痛大鼠进行氟西汀灌胃治疗作为疗效对照。
　　强迫游泳结果显示，与模型组相比，电针组大鼠的游泳静止时间显著缩短，但挣扎时间没有显著差异;假电针对神经痛大鼠的抑郁样行为没有治疗作用。氟西汀连续给药10 mg/kg与30 mg/kg均能显著缩短神经痛大鼠的游泳静止时间，并且高剂量(30 mg/kg)氟西汀治疗还可延长模型大鼠的游泳挣扎时间。提示电针与氟西汀均可有效改善神经痛大鼠抑郁样行为。
　　高架十字迷宫结果显示，与模型组相比，电针治疗显著提高了神经痛大鼠的开臂进入次数百分比与开臂停留时间百分比。与此相比，氟西汀(10 mg/kg与30 mg/kg)对神经痛大鼠的焦虑样行为均没有显著作用。提示，电针可有效缓解神经痛大鼠焦虑样行为，具有抗焦虑作用。
　　2.电针对神经痛大鼠热痛觉过敏的作用
　　将大鼠随机分为:正常组、模型组、模型+假针组和模型+电针组。采用辐射热对神经痛大鼠电针治疗前后的热痛行为进行评价。结果显示多次电针“百会”穴与手术对侧“阳陵泉”穴对神经痛大鼠的热痛觉过敏没有明显作用。小结:多次电针“百会”穴与手术对侧“阳陵泉”穴可以明显改善神经痛大鼠的抑郁样及焦虑样行为。电针“百会”穴与手术对侧“阳陵泉”穴对神经痛大鼠热痛觉过敏没有显著作用。
　　综上所述，本工作提示:
　　1.在神经痛大鼠脊髓中，NALP1炎症小体被显著激活，激活的炎症小体在脊髓背角浅层主要表达于星形胶质细胞，部分位于神经元。鞘内抑制成熟caspase-1可以有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏并抑制脊髓IL-1β成熟。抗炎分子ATL可以显著抑制神经痛大鼠脊髓内NALP1炎症小体的激活并有效缓解神经痛大鼠热痛觉过敏。
　　2.神经痛大鼠在术后第7天即出现抑郁样与焦虑样行为，并可持续至术后21天。在神经痛大鼠术后第7天，海马中NALP1炎症小体大量激活，其产物成熟caspase-1、成熟IL-1β显著升高。抑制海马内成熟caspase-1可以显著缓解神经痛大鼠抑郁样行为，提示海马炎症小体可能参与神经痛大鼠抑郁样行为的形成。
　　3.多次电针可以显著改善神经痛大鼠的抑郁样及焦虑样行为。

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