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缺血或感染因素对少突胶质细胞前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内外阻断研究

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前言

第一部分 少突胶质细胞抗氧化损伤能力的成熟依赖性研究

1.材料和方法

1.1.实验材料

1.2.主要溶液配制

1.3.实验方法

2.结果

2.1.OL前体和成熟OL的免疫组化鉴定

2.2.OL对H2O2诱导细胞损伤存在成熟依赖性

2.3.OL前体和成熟OL中SOD、GPx和CAT活力及GSH和MDA含量

2.4.Bcl-2、Bax和原Caspase-3的蛋白表达

3.讨论

第二部分 缺血因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究

1.材料和方法

1.1. 实验材料

1.2. 实验方法

2.结果

2.1. 不同浓度H2O2对OL前体死亡的影响

2.2. 姜黄素对H2O2抑制OL前体活力的影响

2.3. 姜黄素对H2O2诱导OL前体凋亡的影响

2.4. 姜黄素对OLs前体抗氧化和氧化物质的影响

2.5. 姜黄素对Bcl-2、Bax蛋白和caspase-3、9活性片段表达的影响

3.讨论

第三部分 缺血因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内阻断研究

1.材料和方法

1.1. 实验材料

1.2 实验方法

2.结果

2.1. 光镜下脑病理评估姜黄素对脑白质损伤的影响

2.2. 免疫组化评估姜黄素对OLs数量的影响

2.3. 姜黄素对脑组织氧化/抗氧化物质的影响

2.4. 姜黄素对脑组织Bcl-2、Bax蛋白及caspase-3、9活化片段表达的影响

3.讨论

第四部分 感染因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究

1.材料和方法

1.1.实验材料

1.2.实验方法

2. 结果

2.1.小胶质细胞免疫组化鉴定

2.2.姜黄素抑制LPS诱导小胶质细胞介导OL前体的凋亡

2.3.姜黄素对小胶质细胞内NO和O2-生成量及iNOS和NAO基因表达的影响

3.讨论

第五部分 感染因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内阻断研究

1.材料和方法

1.1.实验材料

1.2.实验方法

2.结果

2.1.光镜下脑病理评估

2.2.O4、MBP免疫组化结果

2.3.IB4免疫荧光结果

2.4.脑组织中NO和O2-含量

2.5.脑组织中iNOS mRNA表达及其蛋白合成

2.6.Western Blot法检测脑内NAO亚基gp91phox和p67phox的蛋白表达量

3.讨论

结论

参考文献

附件

致谢

攻读学位期间发表和待发表的学术论文

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摘要

脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia,PVL)是目前早产儿脑损伤的最主要类型,为早产儿死亡和其后发生脑瘫和认知行为障碍的主要因为。脑室周围白质主要由髓鞘构成细胞-少突胶质细胞(Oligodendrocyte,OL)所构成。OL由前体细胞发育而来,历经OL前体、不成熟OL以及成熟OL几个阶段。研究表明,在胎龄23～32周,OL前体大量出现于脑室周围白质内,对自由基攻击具有明显易损性,因而OL前体被公认为是PVL病变的主要靶细胞,在早产儿PVL的发病机理中起着关键作用。缺血学说和感染学说是目前诠释早产儿PVL发病机理相并列的两大学说,缺氧缺血可导致反应性氧自由基(ROS)生成显著增加,在OL前体对自由基攻击内在易损性基础上,ROS通过脂质过氧化、蛋白氧化和DNA损伤等途径,导致OL前体死亡。感染/炎症诱导小胶质细胞的激活,是感染型PVL发生发展的重要环节。激活的小胶质细胞介导大量活性氧和活性氮的生成,尤其由NO和O2-·反应后所生成的过氧亚硝酸盐(Peroxynitrite,ONOO-),被认为是导致OL前体死亡的主要毒性因子。不论是缺血性因素抑或是感染性因素,其最终的病理改变均为脑室周围白质OL前体的受损和丢失,而缺血或感染/炎症时产生的大量自由基所介导的OL前体损伤,则可能是PVL发生发展的最终共同通路。迄今对PVL防治尚无有效方法。姜黄素是一种从中药姜黄中提取的酚类物质,具有很强的抗氧化和抗炎症反应作用,可减少自由基的生成和促进自由基的清除,还能减少各种炎症介质的合成和分泌,减少组织细胞氧化性和炎症性损伤。研究表明,姜黄素对缺氧缺血或内毒素引起的肝、心、肾、脑等损害有一定的保护作用,但有关其在PVL中的作用及机制研究尚无报导。
　　 在国家自然科学基金和上海市教委基金的资助下,本课题首先对少突胶质细胞抗氧化损伤能力的成熟依赖性进行研究,在此基础上,从缺血因素和感染因素的角度,分别从细胞和在体两个层面,探讨缺血因素和感染因素对OL前体的毒性作用,以及姜黄素对毒性作用的体内外阻断效果,藉以阐明姜黄素对OL前体的可能保护作用及其内在机制,为今后对早产儿PVL成功防治探索可行性途经。
　　 第一部分少突胶质细胞抗氧化损伤能力的成熟依赖性研究
　　 取SD新生大鼠脑组织分别进行体外OL前体和成熟OL培养,探讨OL抗氧化损伤能力的成熟依赖性。显示在相同H2O2浓度刺激下,OL前体的细胞活力明显低于成熟OL。OL前体的抗氧化物质T-SOD、GSH-Px和CAT活力及GSH含量均明显低于成熟OL,氧化物质MDA含量则显著高于成熟OL。OL前体的促凋亡基因产物Bax和Caspase-3的合成量均明显高于成熟OL,抗凋亡基因产物Bcl-2的含量则显著低于成熟OL,OL前体的Bcl-2/Bax比例亦明显低于成熟OL。上述结果提示,OL对自由基攻击存在成熟依赖性,OL前体的抗氧化酶系统发育不完善以及Bcl-2/Bax比例的差异,是导致OL前体对自由基的处理能力低下、对自由基攻击易损的重要因为。
　　 第二部份缺血因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究
　　 以H2O2损伤OL前体作为氧化应激损伤模型,探讨对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究。显示对培养OL前体应用100μmol/L H2O2刺激,OL前体的活力降至正常对照组的52.7％；凋亡细胞数明显增高；氧化物质MDA含量显著上升,抗氧化物质SOD、GPx和CAT的活性显著降低,GSH含量明显减少；促凋亡蛋白Bax以及活化型caspase-3、9的显著增加以及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低。应用10μg/ml姜黄素则可明显提高OL前体的细胞活力至98.1％；明显抑制H2O2诱导的细胞凋亡；显著增加SOD、GPx和CAT的活性,提升GSH含量以及降低MDA浓度；并明显上调Bcl-2的表达以及抑制H2O2诱导的Bax表达及caspase-3、9的活化增加,提高Bcl-2/Bax的比例。上述结果提示,姜黄素对OL前体氧化损伤的保护作用,与减轻OL前体的脂质过氧化、提高Bcl-2/Bax的比例以及抑制caspases的活化,从而增强OL前体的抗氧化能力、抑制由H2O2诱导的OL前体凋亡。
　　 第三部份缺血因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内阻断研究
　　 对2日龄缺血型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻应用姜黄素50mg/kg.d,从体内评估姜黄素的脑保护效果。脑病理显示两个用药组的脑白质病变较PVL组明显改善,其中重度白质病变的发生率分别较PVL组降低了62.5％和43.8％,另有12.5％的脑白质完全正常；免疫组化显示用药组脑内的O4和MBP染色的IOD值均较PVL组非常显著地增高；并非常明显地抑制由缺氧缺血引起的SOD、GPx和CAT活性的下降、GSH含量的减少,以及MDA含量的升高:用药组的Bcl-2合成量亦较PVL组明显增加,Bax以及caspases-3、9活化片段的合成量均较PVL组明显减少。上述结果提示,姜黄素对缺氧缺血的脑白质保护作用,与其调节脑内的抗氧化系统、以及调节脑内的凋亡相关蛋白的表达有关,从而可显著减轻缺氧缺血引起的OL的丢失,对PVL新生大鼠脑白质损伤起保护作用。
　　 第四部份感染因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究
　　 建立小胶质细胞与OL前体共培养模型,探讨LPS对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体外阻断研究。结果显示LPS对单纯培养的OL前体并无直接毒性,在小胶质细胞与OL前体共存时,LPS诱导小胶质细胞激活,从而介导OL前体凋亡。姜黄素能抑制LPS诱导的OL前体细胞凋亡。LPS刺激使小胶质细胞NO、O2-·的生成量均显著增加,iNOS的基因表达及其产物iNOS的含量均较对照组非常显著升高,NAO亚基胞膜gp91-phox和p67-phox的表达亦较对照组非常明显增加。应用10μg/ml姜黄素,小胶质细胞的NO、O2-·的生成量均明显减少,iNOS基因的mRNA和蛋白表达均较LPS组非常显著降低,NAO亚基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦较LPS组显著减少。上述结果提示,姜黄素对OL前体的保护作用,主要通过抑制LPS诱导小胶质细胞内iNOS的表达和NAO活化,从而减少其产物NO和O2-·的产生,起到保护OL前体的作用。
　　 第五部份感染因素对OL前体的毒性作用及姜黄素对毒性作用的体内阻断研究
　　 对2日龄感染型PVL新生大鼠在PVL前和PVL后即刻应用姜黄素50mg/kg.d,从体内评估姜黄素的脑保护效果。脑病理显示两个用药组的脑白质病变较PVL组明显改善,其中重度白质病变的发生率分别较PVL组降低了25％和18.7％,另有31.3％和34.4％的脑白质完全正常；免疫组化显示用药组脑内的O4和MBP染色的IOD值均较PVL组显著增高；IB4免疫荧光标记显示脑内激活的小胶质细胞数明显少于PVL组；脑内NO含量和O2-·的生成能力均明显降低；脑内iNOS的基因表达及其产物iNOS的合成量均较PVL组非常显著减低；脑内NAO亚基胞膜gp91-phox和p67-phox的合成亦较PVL组非常显著减少。上述结果与体外研究结果一致,提示姜黄素对LPS诱导的感染型PVL的脑白质保护作用,主要与抑制了脑内iNOS和NAO的活化,从而减少NO和O2-·的大量生成有关。
　　 通过上述缺血或感染因素对少突胶质细胞前体的毒性作用、以及姜黄素对毒性作用的体内体外阻断系列研究,初步阐明了缺氧缺血氧化应激以及LPS诱导小胶质细胞激活导致OL前体死亡的相关机理,初步探讨了姜黄素对OL前体的可能保护作用及其内在机制,尤其证实姜黄素在阻断缺氧缺血、感染/炎症导致OL前体死亡的相当有效性,可望为今后对早产儿PVL的成功防治探索可行性途径,提高早产儿生存率和改善生存质量,提高人类素质。

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