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临床感染患者阴沟肠杆菌对抗菌药物敏感性分析及其耐药机制研究

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目的：调查医院临床感染患者分离的阴沟肠杆菌对各类抗菌药物的敏感性，了解不同耐药基因的分布情况，分析其耐药机制和耐药菌株的传播途径及医院内感染的分子流行病学特征，指导临床有效控制耐药菌株在医院内的传播。
　　方法：收集2008年1月至2011年6月天津医科大学总医院临床感染患者分离的非重复阴沟肠杆菌114株，应用Vitek-2 compact系统及微量肉汤稀释法进行药敏试验，采用改良三维试验、超广谱β-内酰胺酶确证试验、改良Hodge试验、美罗培南改良三维试验、EDTA协同试验初筛β-内酰胺酶；降落PCR分别检测四组β-内酰胺酶(AmpC酶、ESBLs、OXA类碳青霉烯酶、A、B类碳青霉烯酶)和Ⅰ类、Ⅱ类整合子基因；单一PCR检测CTX-M基因上游插入序列ISEcpl和aac(6’)-Ib基因。对整合子基因阳性菌株同时进行整合子可变区的扩增，并测序分析整合子可变区携带的耐药基因盒；质粒接合试验检测耐药基因的传播性；应用肠杆菌科重复一致序列(ERIC)方法对产酶菌株进行分子流行病学研究，确定耐药菌株间的亲缘关系。
　　结果：1、药敏结果114株阴沟肠杆菌对所测试的15种抗菌药物体外耐药现象较严重。对亚胺培南、美罗培南敏感率最高(100％)，其次为厄他培南和阿米卡星(97.4%)；对头孢菌素类药物的耐药性以头孢西丁最高(100%)，其次为头孢噻肟(45.6%)。
　　2、表型检测结果头孢西丁改良三维试验阳性检测AmpC酶阴沟肠杆菌株53株(46.5%)；双纸片扩散法检测ESBLs阳性菌株17株(14.9%)；改良Hodge试验检测碳青霉烯酶阳性菌株6株(5.3%)；美罗培南改良三维试验检测产酶菌株14株(12.3%)；美罗培南-EDTA协同试验未检出产酶菌株。
　　3、降落PCR试验检测结果①β-内酰胺酶基因检测结果阴沟肠杆菌携带AmpC酶基因47株(41.2%)，并以MIR型(40/47)为主，其次为DHA型(12/47)，未检测出来CIT型、FOX型、MOX型和ACC型AmpC酶；阴沟肠杆菌携带广谱β-内酰胺酶基因34株(29.8%)，其中阴沟肠杆菌ESBLs检出率为52.9%(18/34)，且以blaCTX-M基因(16/18)为主，在该基因上游均检测到ISEcpl；此外，2株阴沟肠杆菌携带blaOXA-1ESBLs基因，且该基因上游ISEcpl检测呈阴性；非ESBLs基因以TEM型(27/34)为主，2株菌产SHV型(2/34)广谱β-内酰胺酶；未检出碳青霉烯酶基因；②整合子检测结果26株(22.8%)阴沟肠杆菌Ⅰ类整合子(intI1)检测阳性，其中23株扩增出整合子可变区，3株未检出可变区；共检出2种整合子可变区：700 bp2株，1000 bp21株，经测序比对证实携带4种耐药基因盒，709 bp可变区携带耐药基因盒dfrA15，1087bp18株携带耐药基因盒aadB-aadA2，1009bp3株携带耐药基因盒aadA1；未检出Ⅱ类整合子基因(intI2)；③6株阴沟肠杆菌携带aac(6’)-Ib基因。
　　4、测序比对结果blaMIR、blaDHA、blaCTX-M、blaOXA-1、blaTEM、blaSHV、aac(6’)-Ib分别为blaMIR-3、blaDHA-1、blaCTX-M-3/14、blaOXA-1、blaTEM-1、blaSHV-11和aac(6’)-Ib-cr基因。
　　5、阴沟肠杆菌质粒接合试验15株(15/16)CTX-M基因阳性菌株接合试验成功。
　　6、ERIC将63株产酶阴沟肠杆菌分成11个基因型，其中：A型共26株，为主要流行克隆株：B型9株，C型8株，D型8株，E型2株，F型2株，G型2株(产OXA-1型ESBLs)，H型2株，I型2株，J型1株，K型1株。
　　结论：(1)本研究阴沟肠杆菌产酶菌株对多种抗菌药物呈现耐药现象；(2)耐药表型检测试验可作为菌株是否产酶的初筛试验，但仍需经PCR确证耐药基因的存在与否；(3)AmpC酶、广谱β-内酰胺酶和Ⅰ类整合子广泛分布于临床分离阴沟肠杆菌中；(4)阴沟肠杆菌对碳青霉烯类敏感性降低或出现耐药可能与其产AmpC酶、ESBLs相关；(5)ISEcpl与CTX-M基因有密切的联系并可能参与了CTX-M基因表达的调控；(6)Ⅰ类整合子主要介导对氨基糖苷类和甲氧苄啶类抗菌药物耐药；(7)aac(6’)-Ib-cr可同时介导对氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物耐药；(8)阴沟肠杆菌所携带的质粒可以介导耐药基因在细菌间进行传播；(9)ERIC检测结果显示阴沟肠杆菌医院内存在部分克隆株传播状况。

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