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结核杆菌环介导等温扩增检测方法及间接ELISA检测方法的研究

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结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性人畜共患病。据估计，全球约有1/3的人口被结核感染，准确、及时地对结核患者进行诊断是治疗和控制结核所必需的。结核菌素实验是临床诊断结核常用的方法，也是国际动物卫生组织与我国认可的法定检疫方法。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的抗原组份,检测时容易出现假阳性,并且此检测不能区分自然感染者与卡介苗免疫者。此外还有很多结核病的诊断方法如细菌培养、痰检、PCR、IFN-Y诊断法等,但这些方法的缺点是检测时间长,操作烦琐,需要昂贵的仪器设备,而且要有专门的人进行操作等,因此不利于结核病的检测。基于以上原因，本实验研究了两种新型的结核检测方法：
　　 一、建立一种快速、高敏感、高特异、鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法。实验根据大多数致病性结核分枝杆菌共有序列esat-6,结核分枝杆菌和牛分枝杆菌gyrB共有特异性序列，以及结核分枝杆菌种特异序列mtp40设计6对特异性引物对痰液中的结核分枝杆菌进行检测，并与鉴别培养基分离培养结果以及常规PCR鉴定结果进行比较。实验结果表明，建立的LAMP检测方法具有很高的特异性。可区分致病性结核分枝杆菌和非致病结核分枝杆菌，也可鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。LAMP检测技术的灵敏度比经典PCR技术高100倍左右，可检测到7拷贝/反应。另外,用三种方法检测样品发现，LAMP与细菌培养的符合率为90.91％，LAMP与常规PCR检测结果的符合率为100％。该检测方法可以在流行病学调查及现场快速诊断方面广泛应用,并为临床治疗提供依据。
　　 二、采用多抗原组合的方法建立一种特异性高，灵敏度好的结核血清学诊断方法。利用分子生物学方法克隆、表达抗原蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c，并用蛋白纯化试剂盒进行纯化。将四种蛋白ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c按1：1：1：1组合，作为诊断抗原来检测血清中的结核抗体。最终以ESAT-6、CFP10、ACR和Rv2626c作为诊断抗原建立了间接ELISA方法,并确定了ELISA诊断方法的判定标准,即S/P≥0.235为阳性,S/P<0.202为阴性,0.235>S/P≥0.202为可疑。ELISA方法的特异性为95.8.％、敏感性为65.0％。对20份痰检阳性和120份健康人血清样品进行了检测,并与痰检结果比较。20份痰检阳性血清样品中有13份为ELISA检测阳性,阳性符合率为65.0％,120份健康人血清，5份为阳性，其余为阴性，阴性符合率为95.8％,本ELISA方法与痰检诊断方法总符合率为91.4％。研究表明,ELISA方法具有很好的开发和应用前景。

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