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【6h】

Oct-4在精原干细胞定向诱导分化中的表达及其甲基化的研究

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目的：体外分离培养小鼠精原干细胞(mouse spermatogonial stem cells,mSSCs)，并通过干细胞因子（SCF，stem cell factor）诱导其向精母细胞方向分化，观察小鼠精原干细胞在诱导分化前后Oct-4的表达情况，并检测其甲基化状态，为进一步研究Oct-4在mSSCs分化中的作用以及探讨表观遗传修饰调节对干细胞分化的影响提供研究思路。
　　 方法：采用与支持细胞共培养法，分离培养6～8天BABL/C小鼠的SSCs，培养48h时用含10％ FBS和50ng/mL SCF的L-DMEM培养基对mSSCs进行诱导分化，观察mSSCs加入诱导剂前后的形态学变化，用c-kit、GCNF的表达鉴定mSSCs是否发生分化。分别采用RT-PCR和间接免疫荧光染色技术，从mRNA和蛋白水平检测Oct-4在mSSCs诱导分化前和分化后2 d、5d的表达情况，运用甲基化特异性PCR检测Oct-4在mSSCs诱导分化前和分化后2 d、5d的甲基化状态。
　　 结果：1、形态学观察mSSCs细胞核较大，细胞质少，SCF诱导培养后，随着培养时间的延长，细胞克隆逐渐增长缓慢，并出现衰退、凋亡的细胞；2、间接免疫荧光染色显示，mSSCs表达c-kit，不表达GCNF，但诱导5d后不表达c-kit，表达GCNF；3、间接免疫荧光染色和RT-PCR显示，Oct-4在mSSCs诱导前表达水平最高，诱导2 d后下降，5d后几乎不表达；4、甲基化特异性PCR显示，Oct-4在mSSCs诱导前未发生甲基化改变，诱导2 d检测到其甲基化状态改变，诱导5d甲基化水平增高。
　　 结论：(1) mSSCs在诱导分化前后的形态及c-kit，GCNF表达的变化，提示其用SCF诱导后发生了分化；(2)Oct-4在mSSCs诱导前表达水平最高，用SCF诱导后表达下调乃至不表达；(3)Oct-4在mSSCs诱导分化前后有甲基化状态的改变，且甲基化水平与表达呈负相关。

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