• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >低蛋氨酸对Caco-2肠上皮细胞紧密连接蛋白表达和功能的影响
【6h】

低蛋氨酸对Caco-2肠上皮细胞紧密连接蛋白表达和功能的影响

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

声明

致谢

摘要

中英文缩略词对照表

1 引言

2 实验材料及方法

2．1 主要实验材料和试剂

2．2 实验方法

2．3 实验结果统计学分析

3 结果

3．1 Caco-2肠上皮细胞模型的评估

3．2 低蛋氨酸对Caco-2体外肠黏膜屏障模型及其损伤模型的影响

3．3 四组Caco-2肠上皮细胞紧密连接超微结构的比较

3．4 四组Caco-2细胞紧密连接蛋白检测的结果

3．5 各组细胞紧密连接蛋白免疫荧光实验结果

3．6 MLCK-P-MLC信号通路的检测

3．7 Rho／ROCK信号通路的检测

4 讨论

5 结论

参考文献

微生物感染与炎症性肠病关系的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果

展开▼

摘要

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一组慢性非特异性肠道炎症性疾病，常见为克罗恩病(CD)与溃疡性结肠炎(UC)，部分为炎症性肠病未定型(IBDU)。IBD病因及发病机制尚未明确，可能与遗传、环境、微生物感染以及免疫反应等多种因素有关。近年来，肠黏膜屏障功能在IBD发生发展中的作用受到了广泛研究。肠黏膜屏障功能受损既是IBD疾病的表现，又是IBD潜在的致病因素，同时增加IBD复发的风险。所以，维持和恢复肠黏膜屏障功能将有利于提高肠黏膜的防御功能，促进肠黏膜修复有助于维持缓解、减少IBD复发。研究表明，限制蛋氨酸含量能够增强上皮细胞屏障功能。低蛋氨酸处理的LLC-PK1上皮细胞和给予低蛋氨酸饮食的SD大鼠细胞旁路通透性降低，细胞以及大鼠屏障功能增加，紧密连接蛋白的组成和表达发生变化。另外，项目组前期动物实验发现，低蛋氨酸饮食显著降低正常大鼠肠道通透性，并能减轻IBD大鼠肠黏膜炎症损伤，通过改变紧密连接蛋白的表达和功能而增强正常大鼠和IBD大鼠的肠黏膜屏障功能，促进肠黏膜损伤的修复。然而，低蛋氨酸对于受损肠屏障的保护机制并不清楚。由此，我们进一步通过Caco-2肠上皮细胞模型对上述结论进行验证，并检测相关信号通路，初步探索其可能的机制。
　　目的:在动物实验的基础上，进一步研究低蛋氨酸对Caco-2肠上皮细胞及其紧密连接损伤体外模型的影响，并分别检测MLCK-P-MLC以及Rho/ROCK信号通路，初步探索在炎症状态下，低蛋氨酸对紧密连接蛋白表达和功能影响的可能的调控机制。
　　方法:建立Caco-2肠上皮细胞模型，并通过形态学观察、单层细胞完整性及旁路通透性检测、细胞极性研究四个方面联合评价Caco-2模型的可靠性和有效性。根据是否使用低蛋氨酸培养基以及是否经过TNF-α处理48h，将Caco-2细胞分为四组:AA组（对照组）、MR组（低蛋氨酸培养组）、AA+TNF组（正常培养条件下TNF-α处理48h组）、MR+TNF组（低蛋氨酸培养条件下TNF-α处理48h组）。分别检测各组细胞的跨上皮细胞电阻（transepithelial electrical resistance，TEER）、荧光黄(luciferyellow, LY)透过率和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性;应用透射电镜观察Caco-2单层细胞紧密连接以及微绒毛结构的改变;通过qPCR、Western blot以及免疫荧光等方法，定位、定量检测紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1;Western blot实验分别检测MLCK-P-MLC信号通路、Rho/ROCK信号通路各相关蛋白的相对表达量，从蛋白水平分析炎症状态下低蛋氨酸对紧密连接蛋白表达和功能影响的可能的调控机制。
　　结果:
　　(1)Caco-2肠上皮细胞体外模型建立成功，具有很好的重复性和可靠性。
　　(2)加入TNF-α培养48h之后，Caco-2肠上皮细胞TEER值显著降低（P＜0.01），荧光黄透过率显著增高（P＜0.01）;MR组与AA组相比，TEER值显著升高（P＜0.01），细胞极性显著增加(P＜0.05)，但荧光黄透过率没有发生显著改变;MR+TNF组与AA+TNF组相比，TEER值显著增加且荧光黄透过率显著降低(P＜0.05)。
　　(3)透射电镜的结果表明，不论正常培养还是低蛋氨酸处理的Caco-2肠上皮细胞，紧密连接结构均位于细胞膜外侧顶端，呈致密带状结构，微绒毛排列紧密、整齐;TNF-α诱导损伤后，肠上皮细胞紧密连接结构破坏、断裂，微绒毛脱落、稀疏、排列紊乱，可见局部微绒毛消失;低蛋氨酸能够减轻TNF-α诱导的紧密连接损伤，减少微绒毛的脱落。
　　(4)qPCR和Western blot的结果表明，各组细胞紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA和蛋白相对表达量没有显著性差异。
　　(5)免疫荧光结果显示，AA组和MR组Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白沿细胞膜分布，呈蜂巢状线性荧光，TNF-α能诱导紧密连接蛋白异常分布，可见不连续的线性荧光染色，细胞间出现间隙，环断裂，甚至崩解，但MR+TNF组紧密连接的结构和分布变化较AA+TNF组明显好转。
　　(6)Western blot实验对MLCK-P-MLC信号通路的检测结果显示，细胞经TNF-α刺激后，MLCK与pMLC蛋白水平显著增加(P＜0.05)，说明MLCK-P-MLC信号通路被激活;MR+TNF组与AA+TNF组相比，pMLC以及MLCK蛋白表达量显著降低(P＜0.05)，即低蛋氨酸环境能够减弱TNF-α对MLCK-P-MLC信号通路的激活作用。
　　(7)Western blot实验对Rho/ROCK信号通路的检测结果显示，细胞经TNF-α刺激后，p-MYPT1、ROCK1以及ROCK2蛋白水平显著增加(P＜0.05)，说明Rho/ROCK信号通路被激活;MR+TNF组与AA+TNF组相比，p-MYPT1、ROCK1以及ROCK2蛋白相对表达量没有显著性差异。
　　结论:
　　(1)Caco-2肠上皮细胞体外模型建立成功，通过联合评价的方法从形态学观察、TEER值测定、荧光黄透过率测量以及碱性磷酸酶活力测定四个方面来综合评价Caco-2细胞模型的建立，本模型具有很好的重复性和可靠性。
　　(2) TNF-α能够改变紧密连接蛋白的结构和空间分布，使得细胞旁路通透性增加，肠上皮细胞屏障功能受损。
　　(3)低蛋氨酸能够增强肠上皮屏障功能，并且能够改善TNF-α诱导的肠上皮细胞屏障损伤，这种保护作用可能主要是通过改变紧密连接蛋白的结构和空间分布，而对紧密连接蛋白的表达没有影响。
　　(4) TNF-α能够激活MLCK-P-MLC信号通路以及Rho/ROCK信号通路，而低蛋氨酸对肠上皮屏障功能的保护作用可能由于低蛋氨酸环境能够减弱TNF-α对MLCK-P-MLC信号通路的激活作用。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号