五种乳酸杆菌益生菌株对变形链球菌生长及生物膜形成影响的研究

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[目的]
　　变形链球菌（Streptococcus mutans，MS）是一种在口腔中与龋病相关的最常见的细菌，乳酸杆菌(lactobacilli bacteria，LB)和双歧杆菌是最常见的益生菌，同时也被认为是龋病的致病菌之一。目前关于它们对变形链球菌作用的研究较少，其抑制变形链球菌的机制还未明确。本研究的目的在于通过菌落计数观察不同种类LB及其上清液对MS生长的作用，并通过荧光显微镜观察LB上清液对MS生物膜的抑制作用，同时研究益生菌对高龋儿童口内MS临床分离株的生长的影响，初步研究LB抑制MS的作用及其作用机制，探讨其预防龋病的临床应用价值。
　　[材料和方法]
　　1.LB及其上清液对MS的抑菌作用:
　　实验组选取五种LB菌株(L.casei Shirota,L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ，L.paracasei Lpc-37，L.rhamnosus HN001)1×106 CFU/ml,1×108 CFU/ml,3×108CFU/ml三个浓度各0.25 ml，加浓度为1.5×108 CFU/ml MS菌液0.25 ml和1.5 ml BHI液体培养基，对照组LB菌液以金黄色葡萄球菌ATCC25923菌液代替。LB上清液对MS的抑制实验中，未经过和经过pH调节和超滤处理的五种LB上清液代替上述步骤中的LB菌液，对照组LB上清液以MRS肉汤代替，分别37℃6％ CO2培养箱培养24小时，梯度稀释，计数MS菌落。
　　2.LB对MS生长及生物膜形成的抑制作用:
　　实验组取1.5×108 CFU/ml浓度的MS悬液0.1ml，加入内置盖玻片的无菌培养皿中，分别加入9.5 ml BHI液体培养基，0.4 ml上述五种LB上清溶液，对照组LB上清液由0.4 ml生理盐水代替，6％ CO2培养箱培养24小时获取和固定生物膜，用0.01％的吖啶橙AO进行染色，荧光显微镜下观察。
　　3.SDS-PAGE
　　LB上清液经过超滤后冷冻干燥，溶于100 ul超纯水，置于15％的Tris-HCL预制胶电泳90分钟，考马斯亮蓝R250染色摄片观察。
　　4.对MS临床分离株的抑菌作用
　　按照ICDAS标准，选取高龋儿童20例作为实验组，用MSB选择性培养基从唾液中分离MS，按方法1测定五种LB对MS分离菌株生长抑制情况。同时按方法2制备混合菌斑生物膜并观察LB对生物膜内链球菌的影响。
　　[结果]
　　1.LB及其上清液对MS抑菌作用:五种LB在1×108 CFU/ml，3×108 CFU/ml浓度下可抑制MS的生长(P＜0.05)，未经过pH调节和超滤处理的五种LB上清液及经过pH调节和超滤处理处理后的上清液L.casei Shirota和L.rhamnosus HN001对MS生长仍有抑制效果(P＜0.05)
　　2.LB上清液对MS生物膜抑制作用:未经过pH调节和超滤处理的五种LB上清液都能抑制MS及其生物膜生长(P＜0.05)，经过pH调节和超滤处理的L.casei Shirota和L.rhamnosus HN001的上清液对MS生物膜仍有抑制效果(P＜0.05)
　　3.LB上清液SDS-PAGE:L.casei Shirota和L.rhamnosus HN001的上清液在6.5kDa处与MRS肉汤对照组相比可见增强的一条条带。
　　4.LB对MS临床分离株的抑菌作用:L.casei Shirota，L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ，L.paracasei Lpc-37对高龋儿童唾液中MS抑制率分别为72.27％、62.82％、64.42％、68.58％，混合培养后四种LB对变形链球菌均有抑制作用(P＜0.05)。L.casei Shirota，L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ， L.paracasei Lpc-37能够显著减少生物膜中链球菌和MS的数目(P＜0.05)，同时自身的粘附量未见显著增加(P＞0.05)。
　　[结论]
　　五种LB菌株（L.casei Shirota，L.casei LC01，L.plantarum ST-Ⅲ，L.paracaseiLpc-37，L.rhamnosus HN001）均可抑制MS的生长;LB各菌上清液能够抑制变MS生物膜的生长，发挥抑菌的作用可能为其中的6.5 kD的多肽;同时五种LB对高龋儿童口内MS临床分离株有较强抑制作用，提示对于龋病预防可能具有良好的应用前景。

著录项

作者
林小龙;
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作者单位

浙江大学;

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授予单位浙江大学;
学科口腔临床医学
授予学位硕士
导师姓名陈晖;
年度 2014
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类龋齿;
关键词
益生菌; 乳酸杆菌; 变形链球菌; 生物膜; 龋病预防;

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