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Ⅰ靶向抑制Notch1信号通路对人喉癌干细胞化疗增敏的研究;ⅡGP73调控的溶瘤腺病毒GD55对前列腺癌干细胞杀伤效果

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摘要

缩略词

Ⅰ 靶向抑制Notch1信号通路对人喉癌干细胞化疗增敏的研究

1.1 引言

1.1.1 喉癌治疗的研究现状

1.1.2 Notch信号通路

1.1.3 肿瘤干细胞的研究进展

1.1.4 放化疗对癌症的治疗效果

1.1.5 实验目的和意义

1.2 材料与方法

1.2.1 实验材料

1.2.2 试验方法

1.3 实验结果

1.3.1 类喉癌干细胞的培养

1.3.2 类喉癌干细胞生长、增殖能力的检测

1.3.3 Western blot和RT-PCR检测类喉癌干细胞相关蛋白表达的变化

1.3.4 MTT检测不同化疗药物对类喉癌干细胞生长的抑制效果

1.3.5 pKC-Noteh1和pLK0.1 -shRNA质粒的构建及鉴定

1.3.6 稳转细胞株Hep2iNotch1+,Hep2Notch1-,Hep2pKC和Hep2pLK0.1 的筛选和鉴定

1.3.7 MTT法检测细胞增殖

1.3.8 RT-PCR、Western Blot检测凋亡相关因子Bax蛋白及细胞周期调控因子p21和p-Akt的表达

1.3.9 MTT检测顺铂(DDP)对Hep2WT,Hep2Notch1+,Hep2Notch1-的杀伤效果

1.3.10 流式检测DDP处理后三种细胞的凋亡情况

1.4 讨论

1.5 结论

Ⅱ GP73调控溶瘤腺病毒GD55对前列腺癌干细胞杀伤效果的研究

2.1 引言

2.1.1 前列腺癌干细胞模型和标志物

2.1.2 前列腺癌的研究进展

2.1.3 溶瘤腺病毒的研究进展

2.2 实验材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.3 实验方法

2.3 实验结果

2.3.1 MTT检测ZD55/GD55对前列腺癌细胞的杀伤作用

2.3.2 QPCR和Western检测前列腺癌细胞中GP73表达

2.3.3 前列腺癌干细胞的形态学观察

2.3.4 Q-PCR检测Du145 sphere中干性标志呈高表达

2.3.5 Du145 sphere细胞中干性标记表达升高

2.3.7 各种化疗药物及腺病毒对Du145 sphere细胞的杀伤作用

2.3.8 E1A蛋白在GD55处理组中高表达

2.3.9 GD55对前列腺癌球细胞的杀伤效果更强

2.3.10 GD55比ZD55引起更强的细胞凋亡

2.3.10 GD55对类前列腺癌干细胞的增殖抑制能力强,体内抗癌效果显著

2.4 讨论

2.5 结论

参考文献

硕士研究生期间的研究成果

致谢

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摘要

喉鳞状细胞癌,常发生于人体肿瘤中,发病率和病死率极高,严重危害着人类健康。随着蛋白质组学、分子医学等技术的发展,与LSCC发生发展相关的许多靶点和信号通路(TP53、Notch信号通路等)被发现。在靶向LSCC特异的突变位点和信号通路的研究上,也取得了一定的治疗效果。化疗药物顺铂在减少喉癌远处转移、提高患者生存率、保护器官功能方面至关重要。靶向性或选择性杀伤肿瘤干细胞,有望提高化放疗敏感性,减少癌症转移及复发。
  本研究通过体外悬浮培养类喉癌干细胞,并利用分子克隆构建载体pKC-Notch1和pLK0.1-shRNA载体,包装慢病毒后感染喉癌细胞,然后筛选出Notch1信号沉默和Notch1信号过表达的喉癌细胞株Hep2Notch1+,Hep2Notch1-。用细胞计数法、Q-PCR、Weastern blot等实验方法检测上述细胞相关因子的表达和细胞周期等生物学特性。MTT实验以及流式分析化疗药物顺铂对Hep2WT,Hep2Notch1+,Hep2Notch1-的杀伤效果。运用克隆形成实验和细胞计数法检测得到类喉癌干细胞增殖能力弱,多处于静息状态G0-G1期。Q-PCR和RT-PCR结果显示在类喉癌干细胞中,CD44、ALDH、p-AKT、bcl2和p21表达显著上调,而Notch1、bax和AKT下调;进一步运用western blot方法证实:在Hep2sphere细胞中p-AKT、bcl2和p21蛋白表达表达显著上调,Bax和AKT蛋白表达下调。Notch1信号沉默后,细胞增殖速度加快,AKT蛋白,促凋亡蛋白Bax下调,同时p21蛋白表达也减少。在用化疗药物顺铂处理后,细胞存活率相较野生型喉癌细胞更高。相反,Notch1信号过表达的喉癌细胞,细胞增殖速度明显下降,促凋亡蛋白Bax表达增加,AKT蛋白和抑癌蛋白P21表达量也上升。在相同浓度DDP处理后,细胞存活率明显低于Hep2WT,Hep2Notch1-细胞。结果说明悬浮培养的类喉癌干细胞具有喉癌干细胞特性。并且阿司匹林(Aspirin)和腺病毒ZD55-TRAIL对类喉癌干细胞具有较强杀伤效果而对分化的喉癌细胞影响较弱;DDP、DOX和5-Fu则相反。Noch1信号在喉癌细胞表现出抑制喉癌细胞增殖,促进Hep2细胞凋亡的特性,并且促进p21信号表达,启动抑癌机制,使细胞更多地停留在G1期。同时,Notch1信号的过表达促进了化疗药物顺铂对喉癌细胞的杀伤作用。而阻断Notch1信号通路,会促进喉癌细胞增殖,减少凋亡,并且增强喉癌细胞对DDP的耐药性。由此可见,Notch1信号在喉癌中起抑癌作用。前列腺癌已成为危害男性健康的最大问题之一。与其他肿瘤相比,前列腺癌具有更明显的肿瘤异质性,从而很大程度影响了肿瘤的诊断、治疗以及预后监测。因此,对前列腺癌的研究治疗变得尤为重要。溶瘤病毒能够在不损伤正常细胞的情况下,特异性感染和裂解肿瘤细胞。随着人们对基因和癌症的深入研究,现代生物技术得道逐渐完善,治疗癌症的新型药物和方法不断更新,有些甚至已经应用于临床研究。溶瘤病毒作为抗肿瘤药物的关键在于提高其靶向性和溶瘤效应。目前,开发了一种新型的GP73调控的溶瘤腺病毒GD55靶向前列腺癌、肝癌等,并表现出明显的细胞毒性作用。

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