兔波氏杆菌和巴氏杆菌LAMP快速诊断技术研究

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兔波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）和巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)是引起兔呼吸道传染病的主要致病菌，临床上这两种菌有时呈现混合感染，由于它们在菌落形态、临床症状以及病理变化等方面都存在许多相似的地方，仅靠表面症状容易造成误诊，所以建立一种操作简便、快速灵敏和特异性强的检测方法显得十分必要。环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是Notomi等在2000年开发的一种新颖的核酸扩增技术，通过一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用，在恒温条件下高效、快速、特异地扩增靶基因，不需要PCR的热循环步骤和繁琐的电泳检测过程，为病原在临床上的快速诊断提供了全新的思路。
　　本研究针对Bb16S rRNA基因和Pm Kmt1基因，使用在线设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物，然后分别对反应温度和时间、dNTPs浓度、Mg2+浓度、Betaine浓度、Bst DNA Polymerase浓度以及引物浓度进行了优化，建立了LAMP反应体系。
　　本研究利用LAMP技术对8株兔源性细菌分别进行Bb和Pm的特异性试验，结果显示仅有目标菌株为阳性，其余7株细菌均为阴性，表明LAMP检测技术具有良好的特异性。
　　本研究采用Qiagen试剂盒法制备模板进行LAMP反应，该方法检测Bb和Pm的检出限分别为1.65CFU/mL和1.29CFU/mL，而对照PCR检测Bb和Pm的检出限分别为165CFU/mL和129CFU/mL，表明LAMP技术的灵敏度为普通PCR的100倍。
　　本研究用已优化的LAMP检测方法分别对15份Bb阳性样品和10份Pm阳性样品进行稳定性与重复性试验，检测结果均为阳性，表明该方法具有良好的稳定性与重复性。
　　本研究比较了3种基因组DNA提取方法对LAMP检测结果的影响，研究结果表明LAMP方法对制备模板DNA的要求不高，采用煮沸法提取基因组DNA，不仅节约提取时间，而且也大大降低检测成本。
　　本研究分别检测了54份Bb样品和44份Pm样品，同时与实验室已建立的PCR方法做了比较，结果表明:Bb-LAMP方法的阳性检出率为77.78％，特异性为85.71％，敏感性为100％，符合率为96.3％;Pm-LAMP方法的阳性检出率为47.73％，特异性为88.46％，敏感性为100％，符合率为93.18％。
　　LAMP反应耗时短，可在70min内完成，反应终止后加入1μL SYBR GREENⅠ(1000×)核酸染料，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果，使得整个检测过程更加快速与高效;通过酶切鉴定，测得酶切片段与理论预期值相符，验证了方法的正确性。此外，LAMP反应只需一个简单的恒温水浴锅，不需要昂贵的PCR仪，操作简便，易于在基层推广应用。

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作者
李科;
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作者单位

浙江师范大学;

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授予单位浙江师范大学;
学科动物学
授予学位硕士
导师姓名鲍国连;
年度 2013
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病原细菌;
关键词
波氏杆菌; 巴氏杆菌; 环介导等温扩增技术; 快速诊断;

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