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血清标志物时间分辨免疫荧光分析试剂的研制及在产前筛查中的应用

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产前筛查是采用某利，检测方法定量测定孕妇血清中血清标志物的浓度，结合孕妇的个体资料，通过统计分析得出孕妇怀有先天异常儿的风险率，以辅助医生进一步诊断，具有经济、简便、无创伤性等优点。产前筛查的先天异常病种主要包括唐氏综合征(DS，21三体综合征)、爱德华综合征(18三体综合征)和神经管缺陷(NTD)等。常用的血清标志物包括：游离p人绒毛膜促性腺激素(freeβ-hCG)；甲胎蛋白(AFP)；游离雌三醇(FE3或uE3)；妊娠相关蛋白A(PAPP-A)等。其中freeβ-hCG是唯一一个能应用孕早期和孕中期筛查的血清标志物。
　　 时间分辨免疫荧光分析技术(Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)具有制备简便、储存时间长、无放射性污染、重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。国内外广泛使用的血清标志物检测试剂为PerkinElmer公司的时间分辨系列试剂(70％的产前筛查实验室采用)，其freeβ-hCG采用稀土元素钐进行标记。目前国内研制的三种时间分辨荧光检测仪只能检测铕螯合物的荧光信号，因此此试剂在国内的应用受到一定程度的限制。
　　 目前，我国产前筛查的普及率不高，先天异常患儿出生数目居高不下，主要原因如下：一方面绝大多数的医疗机构都使用国外研制的筛查试剂和风险评估软件，价格非常昂贵；同时进口freeβ-hCG-TRFIA试剂不能采用国内仪器检测，不利于广泛应用；另外更重要的是，国外研制的产前筛查风险评估软件是建立在欧美等国家白种人孕妇的数据基础上，各血清标志物中位数水平与中国孕妇有较大的差异，这在很大程度上影响了筛查的准确性。本研究研制铕螯合物标记的freeβ-hCG-TRFIA试剂，对已有AFP-TRFIA、FE3-TRFIA和PAPP-ATRFIA试剂进行优化、中试生产和性能评价，并检测大样本进行产前筛查的正常孕妇血清，建立中国人群的各血清标志物中位数水平，并结合阳性病例进行验证分析，为开发适用于中国人群的产前筛查风险评估软件奠定基础。
　　 方法：
　　 1.研制freeβ-hCG-TRFIA试剂。通过正交实验，从四株抗体中，挑选到一对特异性强、亲和力高、结合牢固的配对抗体；探索包被浓度和铕螯合物与标记抗体的比例及铕标抗体的稀释度，选用剂量曲线线性好、得率较高的标记比例和稀释度；比较不同孵育时间对免疫反应的影响；用国家标准品和PE的freeβ-hCG试剂进行试剂校准品浓度进行标定：检测所选抗体的特异性；研究血清样本freeβ-hCG浓度在不同储存条件下的热稳定性。经过以上探索，选定试剂的主要原材料，确定了基本的反应模式和生产工艺流程；然后进行巾试生产，对freeβ-hCG-TRFIA试剂进行检测性能评价，包括最低检测量、准确性、线性检测范围、剂量反应曲线线性、精密度、干扰试验等。
　　 2.对本单位研制的AFP-TRFIA、PAPP-A-FRFIA、FE3-IRFIA进行校准品浓度的标定、优化、中试生产和试剂检测性能评价(指标同freeβ-hCG-TRFIA试剂)，为后续大样本血清标志物浓度测定的准确性提供保证。
　　 3.采用PerkinElmer公司同类对照试剂和自制试剂平行检测孕妇血清样本，计算两种方法测值的一致性，考核自制试剂的临床检测性能。freeβ-hCG项目平行检测998份孕妇血清样本，AFP项目平行检测408份，PAPP-A项目平行检测516份，FE3项目平行检测1168份。
　　 4.收集进行产筛筛查的正常孕妇血清26579份，其中孕早期5301份，孕中期21278份。只有怀单胎的正常孕妇入选。使用自制试剂进行检测，孕早期血清检测PAPP-A和freeβ-hCG，孕中期血清检测freeβ-hCG、AFP和FE3。根据末次月经周期(LMP)和采样日期计算孕周，将四种血清标志物浓度按孕周进行分类；采用直接法计算中位数：将每个孕周所有孕妇的某血清标志物进行描述性统计分析，统计浓度分布、中位数、均值、百分位数等指标；将测值从小到大排序，位置居中者即该孕周的中位数(media)；将每位孕妇的血清标志物测值除以该孕周的中位数即其中倍数(MoM)。
　　 5.收集31例阳性病例孕妇血清(18三体3例，21三体21例，NTD2例，其他异常5例)，检测各血清标志物浓度，以本研究建立的中位数水平为基准，计算出各血清标志物的MoM，其样本均数与正常孕妇相应的总体均数之间进行t检验，分析阳性病例组与正常对照组之间MoM是否有显著性差异。
　　 结果：
　　 1.freeβ-hCG-TRFIA试剂根据反应结果，选择抗freeβ-hCG单克隆抗体ab11382为包被抗体，抗β-hCG单克隆抗体10-C25C为标记抗体；包被抗体浓度为2μg/ml，铕标抗体最佳稀释度为1:200；采用双位点夹心一步法，操作简单快捷，仅需孵育1小时；试剂准确性好，以国家标准品为对照，试剂校准品的实测效价与标示效价的比值均在在0.95-1.04之间，两条剂量反应曲线不显著偏离平行：灵敏度高，最低检测量达0.052ng/ml；线性范围宽，最大检测范围可至500ng/ml；剂量反应曲线线性好，四次测试结果决定系数R2均大于0.9988；精密度好，分析内精密度和分析间精密度分别低于5.0％和6.0％；特异性强，hLH(250 U/L)、hTSH(300gU/ml)、hFSH(200 U/L)、hCG(2000 U/L)在本试剂的测定值分别为0.1 ng/ml、未检出、0.1ng/ml和2.2ng/ml；血清样本使用本试剂检测freeβ-hCG时，不受甘油三酯、胆红素、血红蛋白的干扰；采用自制freeβ-hCG-TRFIA试剂和PE公司DELFIA free hCGβ试剂对998份血清样品平行检测，使用SPSS13.0进行统计学分析，两种试剂所测数据具有显著相关性，rs=0.956，P=0.000。
　　 2.36份血清样品，在不同条件下储存，检测温度和冻融对freeβ-hCG测值的影响。实验结果显示，血清样本-20℃储存一个月，freeβ-hCG浓度基本上没有变化：2～8℃储存超过3d，室温储存1d或者冻融2次，freeβ-hCG浓度显著增加；2～8℃7d，浓度增加12.0％；室温放置1 d，浓度即增加34.8％，室温放置7d，浓度增加63.3％；样品冻融一次，浓度仅增加2.3％；冻融两次，浓度则增加20.6％。
　　 3.AFP-TRFIA试剂采用双位点夹心两步法，试剂准确性好，以国家标准品为对照品，试剂校准品的实测效价与标示效价的比值均在在0.98-1.02之间；灵敏度高，最低检测量达到0.17U/ml；线性范围宽，最大检测范围可至2000U/ml；剂量反应曲线线性好，四次测试结果决定系数R2均大于0.9974；精密度好，分析内精密度和分析间精密度分别低于4.0％和5.0.％；特异性良好，CEA(1000ng/ml)、CA12-5(600U/ml)、CA15-3(500U/ml)、CA19-9(500U/ml)、人血清白蛋白(1000ng/ml)在本试剂的测定值分别为0.28U/ml、0.25U/ml、0.51U/ml和0.42 U/ml；采用自制游离AFP-TRFIA试剂和PE公司DELFIA AFP试剂对408份血清样品平行检测，使用SPSS13.0进行统计学分析，两种试剂所测数据具有显著相关性，rs=0.921，P=0.000。
　　 4.PAPP-A-TRFIA试剂采用双位点夹心一步法，试剂回收率为97.9％，准确性好；灵敏度高，最低检测量达到1.2mIU/L；线性范围宽，最大检测范围可至4000mIU/L；剂量反应曲线线性好，四次测试结果决定系数R2均大于0.9956；精密度好，分析内精密度和分析间精密度分别低于3.0％和5.0％；特异性强，AFP(1000 IU/ml)、人泌乳素(10000 mIU/L)、人胎盘催乳素(12.0mg/L)、人绒毛膜促性腺激素(2000U/L)在本试剂的测定值分别为0.071 mIU/L、0.504mIU/L、1.409 mIU/L、0.727 mIU/L，特异性良好；采用自制游离PAPP-A-TRFIA试剂和PE公司同类试剂对526份血清样品平行检测，使用SPSS13.0进行统计学分析，两种试剂所测数据具有显著相关性，rs=0.995，P=0.000。
　　 5.FE3-TRFIA试剂采用竞争抑制一步法，试剂回收率为107.6％，准确性良好；灵敏度高，最低检测量达到0.18 nmol/L；线性范围宽，最大检测范围可至180 nmol/L；剂量-反应曲线线性好，四次测试结果决定系数R2的绝对值均大于0.9940；精密度良好，分析内精密度和分析间精密度分别低于4.0％和6.0％；特异性强，孕酮(80ng/ml)、雌二醇(4.09 ng/ml)、睾酮(18ng/ml)在本试剂的测定值分别为0.22 nmol/L、0.17 nmol/L、0.25 nmol/L，特异性良好；采用自制FE3-TRFIA试剂和PE公司同类试剂对1168份血清样品平行检测，使用SPSS13.0进行统计学分析，两种试剂所测数据具有显著相关性，rs=0.778，P=0.000。
　　 6.26579份孕妇血清四种血清标志物测值，按相应孕周进行统计，建立AFP和FE3孕14-20w、PAPP-A孕7-13w、freeβ-hCG孕7-20w的中位数水平。试验结果表明：孕早期和孕中期，AFP、FE3、PAPP-A的浓度随着孕周的增加平稳增加，而freeβ-hCG在孕8w达到高峰后，随着孕周的增加不断下降，孕11w下降稍加速外，其他各周平稳下降。
　　 7.本研究建立的中国人群中位数水平与美国PE公司试剂盒提供的白种人孕妇数据有显著性增高，与其他国家的报道也有明显区别。
　　 8.使用本研究建立的中位数，分析唐氏综合征(21三体)病例，其母血AFP、freeβ-hCG和FE3的MoM值均值与正常孕妇各指标均数有显著性差异，21三体病例母血AFP和FE3浓度显著降低，而freeβ-hCG浓度显著增高；分析爱德华综合征(18三体)病例，其AFP、freeβ-hCG、PAPP-A和FE3的MoM值与正常孕妇相比明显偏低；分析神经管缺陷(NTD)病例，其AFP MoM值与正常孕妇相比明显偏高，AFP MoM值均值大于2.5。
　　 9.母血中freeβ-hCG浓度增高和PAPP-A浓度降低，可能与唇裂、腭裂、尿道下裂、鞘膜积液、水肿胎和先天性心脏病等出生缺陷相关。
　　 结论：
　　 自主研制freeβ-hCG-TRFIA试剂采用双位点夹心一步法，具有操作简便快捷、灵敏度和准确度高、检测范围宽等优点，其检测性能优于进口同类试剂，可以适应于国内仪器，能更好地满足临床检测的需要；AFP-TRFIA、PAPP-A-TRFIA、FE3-FRFIA试剂经过优化和校准品浓度标定，试剂的准确性高，检测性能与国外同类产品性能相仿，为后续大样本血清标志物浓度测定的准确性提供保证；本研究建立的中国人群四种血清标志物中位数水平与白种人群数据有显著性差异，此数据库的建立将为研制适应中国人群的的产前筛查风险评估软件奠定基础；阳性病例分析结果表明本研究建立的中位数水平能有效用于风险评估。中位数水平种族差异分析提示各种族在产前筛查过程中应该进行大量的调查建立各自数据库，进行种族校正，以提高检出率。

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