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染色质重塑复合物亚基hSNF5结合蛋白hNOP17的鉴定及功能初步研究

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目录

论文说明:缩写词表

声明

第一部分染色质重塑复合物亚基hSNF5结合蛋白hNOP17的鉴定及功能初步研究

前言

材料与方法

技术路线

实验结果

一、hNOP17表达质粒的构建及鉴定

二、hNOP17与hSNF5的体外结合实验(GST-Pulldown)

三、hNOP17与hSNF5的体内结合实验

四、不同hNOP17删切质粒的构建及表达,与hSNF5的体内结合实验

五、不同hSNF5删切质粒的构建及表达,与hNOP17的体内结合实验

六、hNOP17的组织分布

七、hNOP17多克隆兔抗血清的制备

八、hNOP17与hSNF5的共定位。

九、hNOP17影响hSNF5对p21CIP/WAF1启动子的作用。

讨论

小结

参考文献

Part two: MEKK3 interacting protein in multi-cellular signaling pathway

Abstract

Introduction

Experimental Procedures

Results

Endogenous TRAF7,MEK5 and TAK1 interact with MEKK3

Evidents from FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) detection confirm the interaction of Mekk3 with TAK1

The phosphorylation and kinase activity were crucial for MEKK3 activate NF-κB reporter gene

TAK1 interacted with MEKK3,but phosphorylated TAK1 did not interact with MEKK3

TAK1 inhibited the effect of MEKK3 on NF-κB promoter activity and regulated MEKK3 phosphorylation.

TAB1 restore the effect of MEKK3 on NF-κB promother activity and regulated MEKK3 phosphorylation.

MEKK3 activated NF-κB promoter in TAK1-/-MEFs

TAB1 but not MEKK3 play important role on regulating TAK1 phosphorylation.

TAB1 regulated the phosphorylation TAK1 and the interaction between MEKK3 and TAK1

MEKK3 interacted with IKKβ

Model of the relation between MEKK3,TAK1 and TAB1

Discussion

Summary

REFERENCES

致谢

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摘要

染色质的形成经过多层次包装,同时具有动态结构,使其既能以适合真核细胞核大小的包装形式存在,又能作为模板进行转录、复制、损伤修复。在这种动态结构中起重要作用的酶包括染色质重塑和修饰酶。ATP依赖性染色质重塑复合物是重要的染色质重塑酶,包括四个亚家族:SW12/SNF2、Mi-2/CHD、ISWI、IN080/SWR1。SWI2/SNF2是最早在酵母中发现的ATP依赖性染色质重塑复合物。人类具有同源的SWI/SNF复合物,具有转录激活和转录抑制的双重作用,具体功能根据所调节的基因及复合物的组成的不同而不同。SWI/SNF复合物通过与不同蛋白因子相互作用,是整合多种传导到细胞核的酶的级联信号通路的理想平台。人类SWI/SNF复合物中高度保守的亚基除了ATP酶亚基BRG1/BRM外,INI1/SNF5是基本亚基之一,存在于所有SWI/SNF复合物中。INI1/SNF5的功能包括通过蛋白的相互作用,募集SWI/SNF复合物到基因的启动子区调节转录。INI1/SNF5具有调节细胞周期进程及肿瘤抑制功能,目前研究较多的是其在p53/p21CIP/WAF1及p16INK4a/cyclinD/Rb/E2F通路中的作用。我们的早期研究是以hSNF5为诱饵,通过酵母双杂系统,在人胎脑cDNA文库中筛选得到五个可能的hSNF5结合蛋白。在此,我们对其中一个蛋白hNOP17与hSNF5的结合进行了验证,并对其功能进行了初步探讨。所获得的结果为INI1/SNF5的功能及转录调节机制的研究提供了新的线索: 1.通过PCR,在人胎脑cDNA文库中得到hNOP17全长cDNA片段。构建原核表达质粒,在大肠杆菌内表达GST-hNOP17融合蛋白并亲和纯化。通GST-pull dowm证明GST-hNOP17能够与真核细胞全抽提物中的hSNF5共沉淀,提示在体外实验中hNOP17能与hSNF5结合。 2.构建hNOP17真核细胞表达质粒,并在293T细胞内表达。在293T细胞内共同过表达FLAG-hNOP17及Myc-hSNF5,用标签抗体进行免疫共沉淀实验,证明FLAG-hNOP17能与Myc-hSNF5共沉淀,提供了hNOP17与hSNF5结合的体内实验证据。 3.根据氨基酸残基序列,预测hNOP17蛋白功能结构域及结构域连接区并据此构建了hNOP17的不同删切片段的真核表达质粒,在293T细胞内与hSNF5共同过表达,免疫共沉淀实验发现hNOP17 C木端的亮氨酸拉链结构及N术端的1-56个氨基酸残基是hNOP17与hSNF5结合的重要区域。对hSNF5 C末端进行删切,构建真核表达质粒并进行免疫共沉淀实验,发现hSNF5 C术端是与hNOP17结合的重要区域,具体结合区域有待进一步实验。 4.鉴于hNOP17是一种功能未知的蛋白,因此,以<'32p标记的hNOPl7cDNA为探针杂交包括12种组织mRNA的多组织膜,结果发现hNOP17在12种组织内广泛分布,并且在骨骼肌、脑、肾脏、肝脏、胎盘中表达水平较高。 5.在大肠杆菌内表达hNOP17并纯化包涵体,制备hNOP17的兔多克隆抗血清,Westem-blot结果显示抗血清检测效果特异。 6.构建红色荧光标签的hNOP17真核表达质粒,与Myc-hSNF5共同在293T细胞中过表达,应用细胞免疫荧光染色技术证明hNOP17与hSNF5在细胞内共定位。用hNOP17的兔多克隆抗血清及Myc抗体免疫荧光染色hNOP17及Myc-hSNF5,结果证明hNOP17与hSNF5共定位于细胞核。用hNOP17的兔多克隆抗血清免疫荧光染色神经源性的SH-SY5Y细胞及骨骼肌源性的RD细胞提示内源性hNOP17主要分布于细胞核。 7.通过双荧光素酶报告基因实验,发现hSNF5对p21CIP/WAF1启动子有转录激活作用,hNOP17对p21启动子有抑制作用并且这种抑制作用可以被hNOP17 RNAi去除。共同表达hSNF5及hNOP17,hNOP17能够抑制hSNF5对p21CIP/WAF1启动子的转录激活作用。提示hNOP17与hSNF5在功能上有重要联系。 作为一种新的hSNF5结合蛋白,hNOP17的研究将为hSNF5及SWI/SNF复合物调节基因转录及其它功能的机制研究提供新的证据。我们将进一步研究hNOP17作用于p21CIP/WAF1启动子的机制。

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