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胰岛素受体及其相关信号转导通路参与糖尿病性痛和炎性痛信息传递和调控的机理研究

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第一部分 胰岛素受体在背根神经节及脊髓背角的分布

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

6 小结

第二部分 胰岛素受体及其相关信号转导通路参与糖尿病性痛中信息传递与调控的机制机理研究

1 引言

2 材料

3 方法

4 结果

5 讨论

6 小结

第三部分 胰岛素受体及其相关信号转导通路参与炎性痛中信息传递与调控的机制机理研究

1 引言

2 材料

3 方法

4结果

5 讨论

6 小结

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摘要

以往的研究证实胰岛素受体分布于中枢神经系统和周围神经系统。胰岛素通过结合位于肌肉细胞、脂肪细胞等细胞上的胰岛素受体,促使葡萄糖转运体移位至细胞膜上并摄取葡萄糖。与上述细胞不同,神经元作为一种特殊的细胞,其摄取葡萄糖的方式为胰岛素非依赖机制。此外,由于血脑屏障的阻碍,长期以来人们一直认为胰岛素这种大分子不可能进入中枢神经系统内。然而,随着实验技术的发展,人们在大脑的部分脑区观察到了胰岛素受体,且其分布模式具有特异性和选择性。进一步的研究观察到通过表达于血脑屏障上的一种饱和的、由胰岛素受体作为介导的转运体,胰岛素得以进入中枢神经系统内。
　　但是,关于胰岛素受体在神经系统中的分布和功能仍存在几个问题尚未得到解释:
　　①如果胰岛素受体不直接影响葡萄糖的摄取,那么分布于神经元上的胰岛素受体的功能是什么?由于胰岛素受体的分布具有特异性,那么在传导痛信息通路上是否存在胰岛素受体?
　　②一般认为胰岛素受体及其相关信号转导通路的功能下调是糖尿病的发病机制之一,而糖尿病的神经病变,尤其是糖尿病性痛在糖尿病的病程早期即可出现,那么在神经元上分布的胰岛素受体及其相关信号转导通路与糖尿病性痛的发生和发展是否相关?
　　③除了糖尿病之外,在其他生理和病理情况下,如疼痛自身是否会影响神经元上胰岛素受体及其相关信号转导通路的活性和功能?
　　目前,胰岛素受体及其相关信号转导通路在神经系统中所发挥的作用仍不清楚。为了更好地了解胰岛素受体及其相关信号转导通路在神经元中的功能,尤其是在疼痛状态下的作用,本研究首先观察了痛信息从外周进入中枢的关键部位——脊髓和背根神经节内胰岛素受体的分布模式,其次观察了糖尿病性痛和炎性痛对胰岛素受体及其相关信号转导通路中所涉及的关键分子的表达变化,力求揭示胰岛素受体及其相关信号转导通路在疼痛的发生发展过程中的作用机理。
　　1.胰岛素受体在脊髓及背根神经节的分布
　　借助免疫荧光双重标记技术,探讨了脊髓和背根神经节中胰岛素受体的定位及分布模式。结果表明:
　　(1)在腰段脊髓,胰岛素受体主要分布于神经元中,且集中存在于与痛信息传入相关的脊髓背角浅层。
　　(2)胰岛素受体在背根神经节内多位于传递痛信息的中、小型神经元;这些胰岛素受体阳性神经元亦呈非肽能神经元标记物IB4和肽能神经元的标记物CGRP阳性。
　　以上形态学证据表明胰岛素受体分布于痛信息从外周进入脊髓背角浅层的局部神经环路中。
　　2.糖尿病性痛状态下胰岛素受体及其相关信号转导通路参与痛信息传递和调控的机理研究
　　借助1型糖尿病模型(STZ造模的SD大鼠)及2型糖尿病模型(ob/ob转基因小鼠),结合分子生物学技术和免疫荧光双重标记技术,探讨了糖尿病状态下胰岛素受体及磷酸化胰岛素受体底物1的变化及其潜在原因。结果表明:
　　(1)在ob/ob转基因小鼠的2型糖尿病动物模型及STZ造模的1型糖尿病模型的SD大鼠的腰段脊髓背角,胰岛素受体的表达量明显减少,胰岛素受体底物1的磷酸化水平降低,同时动物表现出明显的机械痛敏。在ob/ob转基因小鼠中同时伴随有 JAK2-STAT3通路的激活,但是腰段脊髓背角的神经元数量不变;在 STZ造模的1型糖尿病大鼠中,脊髓背角中的JAK2-STAT3通路虽未激活,但其中的神经元数量大量减少。这些结果表明在1型糖尿病的状态下,胰岛素受体的减少及其底物1磷酸化水平的降低可能是由于胰岛素的减少和神经元数量减少所致。
　　(2)对1型糖尿病模型大鼠脊髓鞘内进行置管后,通过鞘内连续给予胰岛素治疗可以有效地缓解其机械痛敏,进一步说明1型糖尿病所导致的糖尿病性痛可能是由于胰岛素减少所致。
　　(3)对ob/ob小鼠脊髓鞘内进行置管后,经鞘内给予JAK2-STAT3通路的抑制剂AG490,可观察到模型小鼠的痛行为明显缓解,与未给予药物治疗的对照组动物进行比较,结果表明胰岛素受体表达量的减少及胰岛素受体底物1磷酸化水平的降低均可被逆转。
　　3.胰岛素受体及其相关信号转导通路参与炎性痛信息传递和调控的机理研究
　　借助免疫荧光双重标记技术,观察了脊髓和背根神经节中胰岛素受体与疼痛相关离子通道TRPV1的共存关系。
　　结果表明:
　　(1)胰岛素受体在背根神经节内多位于传导痛信息的中、小型神经元,其中85.6％的TRPV1阳性神经元同时呈胰岛素受体阳性。
　　(2)在腰段脊髓,胰岛素受体的阳性标记产物主要分布于神经元胞体和神经末梢,这些胰岛素受体阳性神经元胞体和神经终末集中分布于跟痛信息传入相关的脊髓背角浅层。这些结果说明胰岛素受体与TRPV1可能共同参与了痛信息从外周进入脊髓背角浅层的过程。
　　使用免疫组织化学染色、Western Blotting及药理行为学等方法,探讨了足底注射完全弗氏佐剂(CFA)导致炎性痛动物模型中胰岛素受体及其相关信号转导通路在炎性痛信息传递和调控中的作用。
　　结果表明:
　　(1)足底注射CFA后,动物表现出显著的热痛敏,并伴随脊髓背角内TRPV1的表达增加;但胰岛素受体的表达却大量减少,尤其是细胞膜上的胰岛素受体明显减少。
　　(2)在炎性痛动物的脊髓内,胰岛素受体底物1的表达量在足底注射CFA后6小时至48小时明显减少;胰岛素受体底物1的磷酸化水平在第24小时降低,但在第48小时,却较对照组明显增加。
　　(3)在PI3K-Akt通路中,PI3K在炎性痛动物的脊髓内自第24小时显著减少,在第48小时,与对照组比较无明显统计学差异。pAkt的表达与PI3K的变化相似,也在第24小时大量减少。
　　(4)在足底注射CFA后的第24小时和第48小时,经脊髓鞘内给予胰岛素治疗,可以明显缓解炎性痛模型动物的热痛敏反应,并且可以有效逆转胰岛素受体表达的下调和TRPV1表达的上调。
　　使用钙成像和药理行为学方法,研究了胰岛素对TRPV1通道功能的影响。结果表明:
　　(1)在急性分离培养的背根神经节神经元上给予TRPV1的特异性激动剂辣椒素可以引起细胞内钙离子水平的增加,而同时给予1 mM胰岛素可以有效地逆转该效应。
　　(2)对正常小鼠进行鞘内置管后,经鞘内给药单独给予0.05 IU(0.4 nmol)胰岛素或等量的生理盐水不会导致舔或咬足等伤害性痛行为,提示胰岛素自身不会导致疼痛。
　　(3)经鞘内给予胰岛素或生理盐水10分钟或25分钟后,使用设置为52.5℃的Hot plate(热板)实验测量小鼠对于伤害性热刺激的反应,结果表明胰岛素可以有效的延长伤害性刺激的潜伏期,表现出镇痛的效应。
　　(4)对正常小鼠进行鞘内置管后,经鞘内给予胰岛素或生理盐水后,立即左侧足底注射辣椒素1.6mg。与盐水组比较,胰岛素可以有效减少舔或咬足等伤害性痛行为反应;再次在同侧足底给予等量的辣椒素,胰岛素可以持续镇痛。
　　综上所述,本研究获得的主要结果如下:
　　(1)胰岛素受体在传导痛信息相关的背根神经节和脊髓背角内大量分布。在背根神经节内传递痛信息的中、小型神经元中,胰岛素受体与肽能初级神经传入的标记物CGRP和非肽能初级神经传入的标记物IB4均有共表达;在脊髓背角,胰岛素受体集中分布于浅层的神经元胞体和终末。
　　(2)1型和2型糖尿病性痛模型动物的机械痛敏阈值随病程而降低,同时伴随脊髓背角内的胰岛素受体大量减少;1型糖尿病动物脊髓背角内神经元的数量减少,但JAK2-STAT3通路并未被激活;2型糖尿病动物脊髓背角内的变化趋势与1型糖尿病动物相反,无神经元数量的减少,但JAK2-STAT3通路随病程而活化。对1型糖尿病动物经鞘内给予胰岛素治疗可以有效缓解其机械痛敏;对2型糖尿病动物经鞘内给予JAK2-STAT3通路的抑制剂AG490可以明显逆转动物的机械痛敏。
　　(3)胰岛素受体及其相关信号转导通路的变化与炎性痛的发生发展密切相关。在CFA引起的炎性痛动物的脊髓内,TRPV1通道的表达上调,同时伴随胰岛素受体及其相关信号转导通路的变化。鞘内给予胰岛素治疗不仅可以明显缓解动物的热痛敏,而且可以有效地减少足底注射TRPV1激动剂——辣椒素引起的伤害性痛行为。

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