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山羊痘荧光抗体检测与PCR方法的建立

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前言

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验毒株、细胞及血清

1.1.2菌体与载体

1.1.3主要试剂

1.1.4主要实验仪器

1.2方法

1.2.1山羊痘荧光抗体试验的建立与应用

1.2.2基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析

1.2.3基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析

2结果与分析

2.1山羊痘荧光抗体试验的建立与应用

2.1.1兔抗GPV高免血清IgG的提纯及纯度鉴定

2.1.2荧光抗体的制备与质量鉴定

2.1.3荧光抗体效价与最适工作浓度测定

2.1.4阳性血清对荧光抗体的封闭

2.1.5荧光抗体的应用

2.2基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析

2.2.1 P32基因PCR方法的建立

2.2.2 P32基因的克隆与序列分析

2.3基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析

2.3.1 ITR基因PCR方法的建立

2.3.2 ITR基因片段的克隆与序列分析

3讨论

4结语

文献综述 山羊痘研究概况

1病原学

1.1分类及形态

1.2理化性质

1.3病毒培养

1.4病毒的纯化与抗原性

1.5病毒基因组

2流行病学

2.1流行情况

2.2流行特点

3临床症状

3.1典型症状

3.2非典型症状

4发病机理

5病理变化

5.1剖检变化

5.2病理组织学变化

5.3显微病理变化

6 诊断

6.1临床诊断

6.2病毒的分离培养

6.3琼脂扩散试验

6.4荧光抗体检测试验

6.5反向间接血凝试验

6.6病毒中和试验

6.7 Western印迹试验

6.8 ELISA试验

6.9 PCR检测方法

7疫苗及免疫

8防制措施

9研究目的与意义

主要参考文献

附录

致谢

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摘要

山羊痘(Goatpox,GP)是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)山羊痘病毒(Goatpoxvirus,GPV)引起的一种高度接触性传染病。临床上以体温升高,全身皮肤、呼吸道和消化道黏膜出现痘疹为主要特征。本病在印度、孟加拉、中东以及非洲中北部地区呈地方性流行,对养羊业造成严重的危害和巨大经济损失。本病被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病,我国也将其列为国家一类动物疫病。 近年来,我国黑龙江、四川和云南等省份相继报道了山羊痘的发生与流行。2002年10月,本病在贵州省首次爆发,并波及了8个养羊较为集中的地区,发病率高达66.38%(2940/4429),死亡率为42.06%(1863/4429);2007年8月,贵州省某地区又一次爆发该病。为对山羊痘疑似病例作出确定性诊断,本研究开展了山羊痘血清学与分子生物学检测方法的研究,取得了以下研究成果: 1.山羊痘荧光抗体试验的建立:采用饱和硫酸铵盐析法和SephadexG-25层析法从兔抗GPV高免血清中提纯IgG,标记荧光素,制备了山羊痘直接荧光抗体,用于检测感染细胞中的GPV抗原。结果表明,该方法能检测出BHK-21感染细胞中的病毒抗原,荧光抗体的最适工作浓度确定为1:32,且这种荧光能够被山羊痘标准阳性血清特异性抑制。用制备的荧光抗体分别检测感染GPV标准弱毒株、疫苗株及贵州分离株的BHK-21细胞抹片和飞片,结果均为阳性,而正常细胞对照均为阴性。 2.基于P32基因PCR方法的建立及其基因序列分析:参照GenBank已发表的GPV基因序列,针对P32基因设计与合成了1对特异性引物,成功地建立了针对P32基因的PCR方法。PCR产物的酶切结果证实该PCR方法具有较好的特异性;敏感性检测显示,其DNA模板最小检出量为19.06×103Pg;利用该方法对贵州省临床痘疹样本进行现场检测,其阳性检出率为100%(10/10)。 采用GelExtractKit试剂盒回收纯化P32基因,与pMD18-T克隆载体4℃连接过夜,转化至感受态细胞DH5a,经PCR和酶切鉴定后送往大连宝生物工程有限公司进行序列测定,结果表明上述4株毒株的P32基因序列与国内外羊痘毒株之间核苷酸的同源性为97.9%~100%,所推导氨基酸的同源性为96.2%~100%。 3.基于ITR基因PCR方法的建立及其基因片段序列分析:针对GPVITR基因设计与合成了1对特异性引物,成功地建立了针对ITR基因片段的PCR方法。经PCR产物的酶切分析证实,该PCR方法亦具有较高的特异性;敏感性检测显示,其DNA模板最小检出量为24.40pg;用该方法对贵州省临床痘疹样本进行现场检测,其阳性检出率亦均为100%(10/10)。 回收ITR基因片段,与pMD18-T载体连接,转化至DH5α,经PCR和酶切鉴定后进行序列测定,结果表明上述4株毒株的ITR基因片段序列与国内外羊痘毒株之间核苷酸的同源性为98.2%~100%,所推导氨基酸的同源性为96.5%~100%。 4.通过PCR的特异性与敏感性检测以及基因序列的同源性比较分析,结果表明,基于ITR基因建立的PCR方法在敏感性及其基因序列保守性上均优于针对P32基因建立的PCR方法,这为临床上山羊痘的确诊建立了一种快速、简单、特异、敏感的PCR方法。

著录项

  • 作者

    徐春志;

  • 作者单位

    贵州大学;

  • 授予单位 贵州大学;
  • 学科 预防兽医学
  • 授予学位 硕士
  • 导师姓名 周碧君,李永明;
  • 年度 2008
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 S852.654;S854.43;
  • 关键词

    山羊痘; 荧光抗体; PCR方法; 序列分析; P32基因;

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