醉茄素A及改型衍生物对胰腺癌生物学效应的影响和其药理学机制的初步研究

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第一部分醉茄素A对胰腺癌细胞生物学效应的影响
　　目的：研究醉茄的活性成分醉茄素A（withaferin A, WA）对胰腺癌细胞生物学效应的影响。
　　方法：用倒置显微镜观察醉茄素A对胰腺癌细胞形态的影响；胰腺癌细胞凋亡的检测用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术；采用CCK-8法检测胰腺癌细胞增殖和耐药；用划痕实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭转移的影响；用PI染色流式细胞学检测胰腺癌细胞周期；CM-H2DCFDA荧光探针标记检测胰腺癌细胞内活性氧（Reactive oxygen species，ROS)水平；用Westrn bolt方法检测细胞凋亡相关蛋白。用Bab/c裸鼠胰腺癌细胞进行皮下注射，通过腹腔注射WA进行检测体内细胞增殖影响。
　　结果：CCK8法和裸鼠皮下成瘤实验表明WA可以在体内外抑制胰腺癌细胞增殖能力，划痕实验和transwell实验证明WA在体外显著抑制胰腺癌细胞侵袭转移能力，Western Blot显示WA能引起Caspase家族蛋白上调，并验证是通过线粒体膜电位下降激活的ROS水平来诱导细胞凋亡；WA阻滞细胞周期于G2/M期。体内实验发现WA对裸鼠模型有肝脏和肾脏纤维化表现。
　　结论：WA可以在体内外抑制胰腺癌细胞增殖，并且可以在体外显著抑制胰腺癌细胞侵袭转移能力。WA可以激活Caspase家族蛋白诱发激活和线粒体损伤诱导的细胞调亡；WA阻滞细胞周期于G2/M期。体内实验发现WA对裸鼠模型有明显的肝毒性和肾毒性等毒副反应。
　　第二部分醉茄素A化学式空间结构改型衍生物对胰腺癌细胞生物学效应的影响
　　目的：根据对醉茄素A活性基团的空间改型衍生物以增加药物脂溶性对胰腺癌细胞生物学效应的影响
　　方法：和华中科技大学同济医学院药学院合作开发醉茄素A化学式空间结构改型，用氢谱检测延伸物。倒置显微镜观察对比WA和改型衍生物对胰腺癌细胞形态的影响；用Annexin V-FITC/PI双标流式细胞术对比检测胰腺癌细胞凋亡影响；采用CCK-8法对比检测胰腺癌细胞增殖和耐药影响；用Transwell法对比检测细胞侵袭转移的影响；用划痕实验和Transwell法检测细胞迁移和侵袭转移的影响；用Western bolt方法检测细胞凋亡相关蛋白。用Bab/c裸鼠胰腺癌细胞进行皮下注射，通过分组进行腹腔注射WA或改型衍生物进行对比检测体内细胞增殖和毒副反应影响。取裸鼠荷瘤提取蛋白运用Western bolt方法检测关键位点蛋白的变化。
　　结果：WA对比衍生物可以在体内外抑制胰腺癌细胞增殖更强作用，划痕实验和transwell实验证明在体外显著抑制胰腺癌细胞侵袭转移能力，而衍生物对胰腺癌细胞侵袭转移能力抑制更显著，Western Blot显示延伸物均能引起Caspase家族蛋白上调趋势，流式细胞学显示延伸物对细胞凋亡有影响较弱。体内实验发现延伸物对裸鼠模型有肝脏和肾脏毒副反应小，但抑制成瘤能力减弱。WA和其衍生物均能激活自噬途径抑制胰腺癌细胞的成瘤能力。
　　结论：WA相比其衍生物在体内外抑制胰腺癌细胞增殖能力更强，但衍生物对胰腺癌细胞侵袭转移能力抑制更强。两者均可以激活自噬途径抑制胰腺癌细胞的生物学效应；体内实验发现衍生物对裸鼠模型的肝毒性和肾毒性等毒副反应小。
　　第三部分醉茄素A及其衍生物通过诱导自噬产生的药理学机制的初步研究
　　目的：初步研究醉茄素A及其衍生物通过诱导自噬的产生药理学机制
　　方法：用电镜检测WA和衍生物作用下的胰腺癌细胞的自噬改变；用Western bolt方法检测WA和衍生物作用下的胰腺癌细胞自噬蛋白表达情况；用C57小鼠模型模拟化疗进行腹腔内注射WA和改型衍生物，观察其肝肾变化，并通过免疫组化和Western bolt方法验证。用关键基因的下调慢病毒和过表达质粒转染正常肝脏和肾脏细胞，Western bolt方法检测自噬的改变。
　　结果：WA和其衍生物可在体外激活自噬途径，可以显著下调晚期自噬SNARE复合体的表达；体内实验发现衍生物对C57小鼠模型的肝毒性和肾毒性等毒副反应小，其肝肾细胞中的SNARE复合体的表达增多。用基因沉默STX17的慢病毒和过表达STX17质粒细胞转染技术，western blot实验验证了SNARE复合体是自噬通路的关键蛋白之一。
　　结论：WA和其衍生物可在体外激活自噬途径，并在体内实验初步证明肝肾细胞中SNARE复合体的表达增多可能与其纤维化表现有关，并在体外初步证明SNARE复合体是影响胰腺癌自噬通路的关键蛋白之一。

著录项

作者
冯业晨;
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作者单位

华中科技大学;

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授予单位华中科技大学;
学科普通外科
授予学位博士
导师姓名秦仁义;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类中药实验药理;
关键词
胰腺癌; 醉茄素A; 毒副反应; 改型衍生物; 药理学机制; 生物学效应; 活性成分;

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