利用Multiple-primerPCR对种公牛进行个体识别方法的建立

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运用种公牛精液基因组中的分子标记进行个体识别可以判断被检样本与目标样本是否一致。本论文选取来源不同的50支种公牛细管精液，采用正交实验法优化了种公牛精液DNA的提取方法，建立了multiple-primer PCR的反应最佳体系，并分析了可用于个体识别的29对微卫星标记，筛选出11对检测效果良好的引物，建立了利用微卫星的个体识别方法。
　　试验一、采用正交实验法优化试剂比例，调整PH值、渗透压和离子浓度等参数，建立了种公牛精液DNA的快速提取方法，即在细管精液加入1mL的消化液，其成分：Tris 50 mmol、EDTA 10 mmol、蛋白酶K 100 mg/L、DTT 10 g/L、NaCl 9 g/L、urea 1 mol/L和SDS 2%。混匀后，于58℃消化1 h， 97℃灭活蛋白酶K 10 min，再用苯酚-氯仿方法抽提，可得到高质量的DNA，OD260/OD280为1.84左右。
　　试验二、通过调节PCR增强剂比例和PH值对Taq酶反应环境进行优化，同时对PCR基本成分（Taq酶、MgCl2和dNTP等）进行调整。利用排列组合方法排除干扰引物，筛选出Multiple-PCR反应的最佳体系，即PH=9.7的 10×buffer（Tris-HCl 100 mmol和KCl 500 mmol)2.5 uL，Taq酶10 U，DDT为8 mmol，dNTP为0.8 mmol，甘油5%，二甲亚砜0.25%和甲酰胺0.5%，DNA模板100 ng，上下游引物除MM12为0.26 μL外，其余均为0.13 μL，最后加水至25 μL。反应程序为95℃预变性5 min，94℃变性30 S，退火使用touch-down方式，温度范围为65-61℃，时间为40 S，72℃延伸45 S，从第2步到第5步10个循环，94℃变性30 S，61℃退火40 S，72℃延伸45 S，从第6步到第8步25个循环，65℃延伸1 h，25℃延伸1 h，4℃保存。通过建立的方法对16个种公牛样本进行验证效果良好。
　　本研究摸索出从种公牛精液快速提取高质量DNA的方法，通过构建multiple-primer PCR的反应体系和反应程序，同时扩增了11对引物，并对检测样本进行检测验证取得较好效果。本研究以精液为检材提高了种公牛个体识别的工作效率，为家畜个体识别研究奠定了理论基础与实验技术。

著录项

作者
赖寿贵;
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作者单位

石河子大学;

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授予单位石河子大学;
学科临床兽医学
授予学位硕士
导师姓名何高明;
年度 2011
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类牛;
关键词
种公牛; 个体识别; 多引物PCR; 微卫星;

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