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【6h】

丹皮酚增强化疗药物对人肝癌细胞的增殖抑制作用及其可能机制

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英文缩略词表

1前言

2实验材料

3实验方法

4.结果

5.讨论

6.结论

7.参考文献

附录

致谢

综述中医药治疗原发性肝癌的研究进展

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摘要

肝细胞性肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，近二十年来，我国HCC的死亡率增加了41.7％，约占全世界HCC死亡人数的42％。目前，手术切除仍是治疗HCC的最佳手段，但本病起病隐匿，病情发展迅速，大多数患者就诊时己发展到中晚期，失去了手术治疗的机会，患者5年生存率低于10％。而顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶等临床一线化疗药物疗效不理想，有效率不超过20％，且大剂量时可引起严重的不良反应，从而限制了临床应用及疗效的进一步提高。近年来从中药和其他天然产物中寻求高效、低毒的有效物质以及探讨这些物质与现有化疗药物的相互作用是目前研究的热点。丹皮酚(Paeonol，Pae)又称牡丹酚，是毛莨科植物牡丹PaeoniaSuffruicosaAndr.根皮和萝摩科植物徐长卿PycnostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schum干燥根或全草的主要有效成分。现代药理研究表明，Pae具有镇静催眠、解热镇痛、抗菌消炎、免疫调节、抗氧化及保护心脑血管等广泛的药理活性。我们在前期研究中发现，Pae对体外培养的多种肿瘤细胞的增殖有较强的抑制作用，体内应用有抗肿瘤作用。本研究选用人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721作为研究对象，探讨Pae及Pae与顺铂等化疗药物联合应用对人肝癌细胞增殖的影响及其可能机制，为将Pae应用于HCC的治疗提供初步的实验依据。 1.Pae对人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721增殖的影响选用人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721，采用MTT法检测了Pae体外抑制人肝癌细胞株增殖的量效和时效关系。结果显示：(1)Pae(7.81～250mg·L-1)对上述两种细胞均有增殖抑制作用，药物浓度越高，抑制作用越强，呈现明显的剂量效应关系。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析：HepG2：r=0.9637，P＜0.01；SMMC-7721：r=0.9439，P＜0,01，IC50值分别为HepG2：58.948mg·L-1，SMMC-7721：89.275mg·L-1。(2)系列浓度Pae作用于细胞12h、24h、48h、72h及96h后观察细胞的生长情况，结果显示Pae作用时间越长，对上述细胞的抑制作用越强，呈时间依赖性。 2.Pae与顺铂(cisplatin,CDDP)、多柔比星(doxorubicin，DOX)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)联合应用对人肝癌细胞增殖的影响选用三个浓度Pae(15.63、31.25、62.5mg·L-1)分别与系列浓度CDDP、DOX以及5-FU联合应用处理HepG2和SMMC-7721细胞，采用CDI分析两药相互作用性质。结果发现，在合适的剂量下，Pae与三种化疗药物均显示出不同程度的协同作用(CDI＜1)，但Pae对三种化疗药物的增效作用各不相同。 3.Pae增效作用的可能机制探讨3.1Pae与CDDP联合应用诱导人肝癌细胞凋亡的形态学改变采用吖啶橙(acridineorange，AO)荧光染色，观察细胞的形态学改变。在荧光显微镜下可见未处理的肿瘤细胞增殖旺盛，细胞质和核仁内有大量RNA，被染为桔黄或桔红色荧光，细胞核中有大量DNA，表现为黄绿色荧光深浅不一的结构样特征；药物处理组作用24h后，细胞密度减少，并可见典型的凋亡细胞形态特征：核固缩、体积缩小和表面起泡，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，联合用药组诱导凋亡作用较单独用药组明显增强。 3.2Pae与CDDP联合应用诱导人肝癌细胞凋亡的琼脂糖凝胶电泳分析应用DNA凝胶电泳法，检测Pae、CDDP以及两者联合应用引起的DNA断裂。药物处理HepG2和SMMC-7721细胞24h后，琼脂糖电泳可见DNA梯状条带(DNAladder)，大约相当于180～200bp的整倍数，提示DNA在核小体间断裂，呈细胞凋亡的典型特征，而培养相同时间的细胞对照组无DNA梯状条带，联合用药组较单独用药组梯状条带明显。 3.3Pae与GDDP联合应用诱导肿瘤细胞凋亡的流式细胞仪分析应用流式细胞仪(FlowCytometry,FCM)检测细胞凋亡率。Pae单独应用可诱导人肝癌HepG2和SMMC-7721细胞发生凋亡，在DNA直方图上G0/G1期前可见亚G1峰即凋亡峰，其诱导凋亡作用呈现明显的浓度、时间依赖关系。Pae与CDDP联合应用24h后凋亡率明显高于单独用药组，提示两药合用对诱导人肝癌细胞凋亡有协同作用。 3.4Pae对细胞周期的影响应用Mcycle软件分析Pae作用后细胞周期的变化。结果发现，Pae可引起人肝癌细胞S期细胞大量堆积，G0/G1期细胞比例明显下降，上述两种细胞均被阻滞在S期。这将有利于CDDP，DOX及5-FU更好的发挥抗肿瘤作用。 4.结论：本文研究结果表明，Pae单独应用对人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721有增殖抑制作用，且呈明显的剂量和时间效应关系；Pae与CDDP等化疗药物联合应用具有明显的协同抑制上述细胞增殖作用，其协同机制可能与诱导凋亡、改变细胞周期有关。

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