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一株喜树内生真菌G4代谢物中抗植物病原菌活性物质的分离与鉴定

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摘要

1 文献综述

1.1 生物农药

1.2 植物内生真菌

1.2.1 植物内生真菌简介

1.2.2 植物内生真菌代谢产物研究概况

1.2.3 内生真菌代谢产物提取分离技术

1.3 喜树及其内生真菌研究进展

1.3.1 喜树简介

1.3.2 喜树内生真菌研究进展

1.4 球毛壳菌及球毛壳菌素

1.4.1 球毛壳菌研究进展

1.4.2 球毛壳菌素研究进展

1.5 苹果腐烂病

1.5.1 苹果腐烂病简介

1.5.2 苹果腐烂病的防治

引言

2 材料和方法

2.1 供试菌种

2.1.1 供试植物病原菌

2.1.2 供试内生真菌

2.1.3 培养基

2.1.4 主要试剂及耗材

2.1.5 仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 技术路线

2.2.2 G4菌与植物病原菌的对峙实验

2.2.3 G4菌摇瓶发酵培养

2.2.4 使用70 M3发酵罐放大发酵培养G4菌

2.2.5 G4菌发酵液的提取

2.2.6 菌丝体的提取

2.2.7 测定发酵液萃取物和菌丝体提取物对苹果腐烂病菌的抑制率

2.2.8 发酵液中抑菌活性物质的纯化分离

2.2.9 抑菌活性评价

2.3.10 其它物质

3 结果与分析

3.1 G4菌对苹果腐烂病菌的拮抗作用

3.2 G4菌发酵液抑制苹果腐烂病菌的最佳发酵周期

3.3 G4菌经70 M3发酵罐发酵的发酵液抑制苹果腐烂病菌的活性

3.4 不同提取剂提取后的发酵液抑制苹果腐烂病菌的活性

3.5 菌丝经不同提取剂提取后得到的提取物抑制苹果腐烂病菌的活性

3.6 发酵液提取物的分离纯化与结构解析

3.7 抑菌活性评价

3.9 其它物质的分析

4 结论

4.1 G4菌放大发酵初探

4.2 生物活性评价

4.3 展望

附图说明

参考文献

附录

作者简介

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摘要

天然活性物质是研制生物农药和农药研究中发现先导化合物的重要来源和宝库。植物内生真菌由于其特殊的生存环境,能够产生结构新颖,生物活性较好的次级代谢产物,从而成为生物农药研究的热点。因此本论文选择以喜树中筛选分离得到的一株球毛壳菌G4菌为研究对象,以苹果腐烂病菌(Cytospora mandshurica)为供试病原菌,研究了该内生真菌的次生代谢产物,共分离鉴定了3个化合物,并对它们的生物活性做出了一定评价。主要研究结果如下:
  (1)研究G4菌不同天数的发酵液对苹果腐烂病菌的抑菌活性,确定其最佳发酵周期为12天;测定不同提取剂提取G4菌发酵液前后的抑菌活性,确定了三氯甲烷为最佳提取剂;通过比较不同提取剂提取菌丝体得到的物质的抑菌活性,确定活性物质主要存在发酵液中。
  (2)测定发酵液和三氯甲烷萃取发酵液所得物质的抑菌活性,其抑菌EC50分别为14169.35μg/ml和0.1928μg/ml。尝试使用70M3发酵罐对G4菌进行放大发酵实验,确定G4菌放大发酵的发酵液抑菌活性为摇瓶发酵的67.8%。
  (3)通过柱层析和高效制备型液相色谱纯化分离得到3个吲哚类生物碱,分别为Chaetoglobosin C(1),Chaetoglobosin U(2)和Chaetoglobosin V(3),均属于球毛壳菌素类家族。测定了化合物1和化合物2在5μg/ml时抑制苹果腐烂菌的活性分别为19.58%和37.06%,化合物3在10μg/ml时抑制苹果腐烂菌的活性为12.79%;三个化合物抑制苹果腐烂病菌的活性相较于混合物抑菌活性,出现活性丢失现象,进一步分析发现,物质在高效制备液相色谱纯化过程中,存在化合物转化现象,且转化后的物质为疑似球毛壳菌素类物质,结合得到的化合物结构均是同分异构体的现象,推测目标活性物质的结构可能是球毛壳菌素类物质,结构不稳定,易发生结构变化。
  综上所述,本实验通过查氏液体培养基发酵一株喜树内球毛壳菌,通过提取、分离和鉴定得到了三个天然产物Chaetoglobosin C,Chaetoglobosin U和Chaetoglobosin V,三个化合物是球毛壳菌素类的细胞松弛素类生物碱,对苹果腐烂病菌有一定的抑菌活性。

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