酸敏感离子通道在酸诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡中的作用及其线粒体途径机制研究

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背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种不明病因的临床综合征,以慢性多关节炎症为主要表现,由于炎症导致关节局部组织酸化,关节腔内滑液pH显著下降。酸敏感离子通道(Acid-sensing ion channels,ASICs)是一类配体门控性离子通道,属上皮钠通道(EnaC)/退化因子基因(DEG)通道家族中的一个成员,能被细胞外pH下降或H+浓度上升激活。本课题组前期研究证实在佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis,AA)大鼠关节软骨细胞上有ASICs的表达,并参与病理情况下的关节软骨代谢过程。
　　目的:本研究以体外培养的大鼠关节软骨细胞为实验对象,采用不同程度的胞外酸化刺激大鼠软骨细胞凋亡,观察ASICs阻断剂阿米洛利(Amiloride)对大鼠软骨细胞凋亡的影响,以探讨ASICs在大鼠软骨细胞凋亡过程中的作用及其可能的分子机制。
　　方法:
　　1.采用Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠关节软骨细胞,将细胞分为四组分别在pH为7.4、6.5、6.0、5.5的培养基孵育,建立关节软骨细胞凋亡体外模型,MTT法检测不同程度酸化刺激对软骨细胞生存率的影响,Hoechst染色法和Annexin V/PI双标记法分别观察软骨细胞凋亡形态和凋亡率的变化。
　　2.将软骨细胞分为pH7.4环境下培养的正常组,pH6.0的酸化组,以及经不同浓度Amiloride(50,100,or200μM)处理的酸化组,MTT法检测不同组别软骨细胞的生存率变化,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色法和Annexin V/PI双标记法分别观察软骨细胞凋亡形态和凋亡率的变化,罗丹明123(Rhodamine123,Rh123)染色在荧光显微镜下检测软骨细胞线粒体膜电位变化,RT-PCR检测各组细胞Bcl-2家族凋亡基因mRNA的表达,比色法、免疫细胞化学检测Caspase-3/9活性和蛋白的表达。
　　结果:
　　1.胞外酸化对体外培养的软骨细胞增殖的抑制作用
　　pH5.5和pH6.0胞外酸化刺激均能明显抑制体外培养的软骨细胞增殖,结合流式细胞仪检测的细胞凋亡率(15.94％、22.18%),酸化组细胞减少可能是由于酸中毒引起软骨细胞凋亡造成的,且凋亡率与酸性程度相关,由此可以推测酸中毒诱导凋亡的能力与酸中毒的程度有关。
　　2.酸敏感离子通道阻断剂(Amiloride)对胞外酸化关节软骨细胞凋亡的影响
　　MTT检测发现Amiloride各剂量组软骨细胞生存率明显高于酸化模型组;AO/EB染色发现酸化模型组早期凋亡细胞增多,表现为细胞核被AO染色呈黄绿色荧光,晚期凋亡细胞亦增多表现为被EB染色呈桔红色;而Amiloride处理组凋亡细胞明显减少;Annexin-V联合PI双标记法行流式细胞术检测结果显示Amiloride各剂量组软骨细胞凋亡率明显低于酸化模型组;Rh123染色结果显示Amiloride各剂量组软骨细胞线粒体膜电位明显高于酸化模型组。
　　3.酸敏感离子通道阻断剂 Amiloride对胞外酸化关节软骨细胞凋亡线粒体途径有关凋亡基因和蛋白表达的影响
　　RT-PCR结果显示Amiloride各剂量组软骨细胞Bcl-2和Bax凋亡基因表达与酸化模型组差异具有显著性;分光光度法检测结果显示Amiloride组软骨细胞Caspase-3/9活性明显低于酸化模型组;免疫细胞化学法结果显示Amiloride组软骨细胞Caspase-3/9、Cytochrome C蛋白的表达与酸化模型组差异具有显著性。
　　结论:
　　1.胞外酸化环境下能明显抑制体外培养软骨细胞增殖、促进软骨细胞凋亡,并随着酸化的程度增加而加剧。
　　2.酸敏感离子通道阻断剂Amiloride对于经胞外酸化处理的体外培养的关节软骨细胞的凋亡有抑制作用。
　　3.利用Amiloride阻断ASICs对酸诱导的软骨细胞凋亡有抑制作用,其可能的机制是通过阻断ASICs,抑制Ca2+超载,保护软骨细胞线粒体功能,调节Bcl-2家簇凋亡基因的表达,控制Cyt-c的释放和Caspase凋亡执行蛋白的活性来实现的。

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作者
荣超;
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作者单位

安徽医科大学;

展开▼
授予单位安徽医科大学;
学科药理学
授予学位硕士
导师姓名陈飞虎,李晓祥;
年度 2012
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类抗变态反应药物;类风湿性关节炎;
关键词
酸敏感离子通道; 类风湿关节炎; 关节软骨细胞; 细胞凋亡; 信号转导; 线粒体;

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