注射型猪小肠黏膜下层复合脂肪间充质干细胞治疗大鼠深Ⅱ度烫伤创面的实验研究

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第一部分、大鼠ADSCs体外分离培养及CM-DiI标记后的传代示踪　　目的：通过体外实验建立一种分离培养大鼠脂肪间充质干细胞（Adipose-derived stem cells；ADSCs）并将其用CM-DiI标记的方法，探讨CM-DiI标记后的细胞用于传代示踪的可行性。　　方法：在无菌条件下剥离出大鼠腹股沟处的脂肪组织（去除血管和筋膜）并将其剪碎，Ⅰ型胶原酶消化脂肪组织，提取出原代细胞，并进行消化传代培养。对各代细胞形态进行观察，将第3代细胞用流式细胞仪进行间充质干细胞表面标志物的鉴定，并将其进行成脂成骨分化诱导，以确定培养出的细胞为ADSCs。用CM-DiI标记第3代ADSCs，荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察此代细胞的荧光标记情况，并用流式细胞仪测定此代细胞的标记率。将标记后的ADSCs继续培养并进行消化传代，在传代至第6代和第9代时，用流式细胞仪分别测定这两代ADSCs的标记率。　　结果：在体外成功提取出ADSCs，其呈现长梭形、鱼群样、旋涡状样的生长。传代后的细胞逐渐纯化，并且生长增殖速度加快，细胞形态无明显变化。第3代ADSCs的表面重要标志物CD29和CD90均阳性表达（表达率分别为95.04％、99.65%），而造血细胞表面标志物CD34、CD45和CD31均阴性表达（表达率分别为0.17%、0.20%、0.14%）。ADSCs能进行成脂成骨的诱导分化。CM-DiI能成功标记ADSCs，标记后的细胞呈现红色荧光，随着代数的增加，荧光强度逐渐减弱，至第9代仍未消失。流式细胞仪测定传代后的ADSCs的CM-DiI标记率，第3代时标记率为97.09%，第6代时标记率为66.21%，而第9代时标记率仍有37.86%。　　结论：大鼠ADSCs具有很强的生长增殖能力，其能阳性表达间充质干细胞的表面重要标志物，且具有成脂成骨的分化潜能。CM-DiI标记ADSCs方便易行，标记率高，示踪效果良好，显示其可成为细胞标记示踪的良好荧光染料，能为后续进一步的体内实验奠定基础。　　第二部分、注射型SIS与ADSCs的体外共培养　　目的：制备可注射型的猪小肠黏膜下层（Small intestinal submucosa；SIS），并探讨其作为注射型生物支架材料与大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)的体外共培养情况。　　方法：将培养出的ADSCs用流式细胞仪进行间充质干细胞表面标志物的鉴定和成脂成骨的分化诱导，并将其进行CM-DiI荧光标记。制备可注射型的SIS并将其与ADSCs复合培养，HE染色观察注射型SIS的脱细胞情况，扫描电镜和荧光显微镜观察注射型SIS及其与细胞复合后的情况。制备100%、75%、50%和25%浓度的注射型SIS材料浸提液，将ADSCs分别在各浓度的材料浸提液下培养，CCK-8试剂盒检测ADSCs在第1、3、5、7天的增殖情况和材料的毒性。Live/dead染色试剂盒检测ADSCs在100%浓度的材料浸提液中第1、3、5、7天的存活情况。　　结果：分离培养出的ADSCs能阳性表达间充质干细胞表面重要标志物且具有成脂成骨的分化能力。HE染色显示注射型SIS上无残留细胞。扫描电镜观察到注射型SIS有较多大小不一的三维孔隙，ADSCs能在材料上很好的黏附，呈椭圆形和条索状生长。CCK-8检测显示与材料共培养的ADSCs增殖率提高且材料无细胞毒性。Live/dead染色试剂盒检测显示ADSCs在100%材料浸提液中存活良好，并且与在完全培养基中培养第1、3、5、7天的死细胞比例没有差别。　　结论：注射型SIS有良好的三维结构，无细胞毒性，与ADSCs复合具有良好的生物相容性，其促进ADSCs的生长与增殖，显示其可作为脂肪组织工程一种注射型的天然生物支架材料，为呈递细胞提供一种新的形式。　　第三部分、注射型SIS复合ADSCs治疗大鼠深Ⅱ度烫伤创面的实验研究　　目的：再生医学为烧伤创面提供了多种治疗方式，寻找良好的皮肤替代物治疗烧伤创面成为一大趋势。为此，本文拟探讨注射型SIS与大鼠ADSCs二者混合物注射治疗大鼠深Ⅱ度烫伤创面的可行性。　　方法：将64只大鼠随机分为A组（空白对照组）、B组（ADSCs组）、C组（注射型SIS组）、D组（注射型SIS﹢ADSCs组），每组16只大鼠，均用100℃沸水作用于大鼠背部皮肤10秒以造模。烫伤后即对创面边缘和中心区域进行注射治疗，A、B、C、D四组分别注射1ml PBS液，1ml含有2×107ADSCs的PBS液，1ml质量分数为20%的注射型SIS，1ml2×107ADSCs和质量分数为20%的注射型SIS的二者混合物，用凡士林纱布和无菌纱布依次覆盖创面，透气胶带环绕包扎大鼠躯干。在二者混合物注射治疗后的第3、7、14、21天采用大体观察、创面微血管密度、组织病理学及组织学免疫荧光的方法来评价二者混合物注射治疗对大鼠深Ⅱ度烫伤创面的修复情况。　　结果：二者混合物注射治疗后的第3天，A、B、C、D四组大鼠创面闭合率分别为7.75±1.30%，13.90±1.01%，14.7±1.10%，19.14±1.56%；第7天，四组大鼠创面闭合率分别为21.45±1.19%，41.34±5.80%，40.62±4.93%，58.28±2.62%；第14天，四组大鼠创面闭合率分别为50.91±1.28%，67.15±0.86%，69.54±0.81%，85.31±1.05%；第21天，四组大鼠创面闭合率分别为62.68±3.14%，82.19±1.61%，88.77±0.73%，100±0%。D组创面闭合率较 A、B、C三组均高（P＜0.01）。二者混合物注射治疗后的第7天，A、B、C、D四组创面微血管密度分别为（11.5±4.6，24.6±6.3，20.1±9.7，39.2±7.3）个/cm2，D组微血管密度均大于A、B、C三组（P＜0.05）。HE染色显示D组新生血管较另外三组多，而炎症细胞浸润最少。呈现绿色荧光的CD31部分能与呈现红色荧光的ADSCs在同一创面区域共存，显示出椭圆状的新生血管结构。二者混合物注射治疗后的第21天，B、C、D三组创面均有新生表皮生成，且D组新生表皮最厚，而A组未见明显新生表皮生成。呈现绿色荧光的CK10部分能与呈现红色荧光的ADSCs在同一创面区域共存，显示出表皮样的结构。　　结论：注射型SIS与ADSCs二者混合物注射治疗能通过提高创面闭合率，促进新生血管生成，减少炎症细胞浸润，促进创面新生表皮再生的作用来促进大鼠深Ⅱ度烫伤创面的修复。

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作者
周虹;
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作者单位

西南医科大学;

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授予单位西南医科大学;
学科外科学
授予学位硕士
导师姓名郭杏;
年度 2017
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类
关键词
深Ⅱ度烫伤,小肠黏膜下层,脂肪间充质干细胞,联合治疗,分离培养,流式细胞仪;

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