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【6h】

抗癌生物活性肽通过Hedgehog信号通路抑制肺癌细胞增殖和诱导凋亡的作用及机制

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声明

前言

实验材料

1 实验用细胞

2 主要仪器设备

3 主要试剂及配置

4 细胞迁移-划痕实验检测ACBP作用后肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞迁移能力的变化

5 FCM 检测 ACBP 作用后肺癌 NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549 和A549/DDP细胞凋亡和细胞周期的变化

6 Western-Blot检测ACBP作用后肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞Gli2和Gli3蛋白表达变化

7 荧光定量PCR检测ACBP作用后肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞Gli2 、Gli3和miR132/212基因表达变化

8 统计学处理

结果

1 ACBP对肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞增殖的影响（MTT检测）

2 ACBP对肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞形态的影响（HE染色）

4 ACBP对肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞凋亡和细胞周期的影响

5 ACBP 对肺癌 NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549 和 A549/DDP 细胞hedgehog信号通路转录因子Gli2和Gli3蛋白的影响

6 ACBP 对肺癌 NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549 和 A549/DDP 细胞hedgehog信号通路转录因子Gli2和Gli3基因及miR-132和miR-212的影响

讨论

结论

附录

参考文献

文献综述:Hedgehog信号通路在肺癌中的研究进展

缩 略 语 表

攻读学位期间发表文章情况

个 人 简 历

致谢

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摘要

目的：探讨抗癌生物活性肽（Anticancer biological activity peptide，ACBP）对人肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞hedgehog信号通路的影响，进一步明确ACBP的抗肿瘤机制。　　方法：体外分别培养五株人肺癌细胞，采用MTT比色法检测 ACBP对肺癌细胞生长增殖的抑制作用，通过细胞苏木精-伊红（HE）染色、Annexin-V/PI染色、细胞迁移-划痕实验、流式细胞术（FCM）等技术检测细胞形态、细胞膜结构、细胞凋亡、细胞迁移能力和细胞周期的改变；应用Western-Blot方法检测Gli2和Gli3的蛋白表达，荧光定量PCR方法检测Gli2、Gli3和miR-132/212基因的表达变化。　　结果：①MTT检测显示，ACBP对肺癌细胞生长增殖具有较强的抑制作用，并呈浓度-效应依赖性；与5-Fu单独用药比较，ACBP/5-Fu作用后对肺癌细胞的IC50降低。②细胞HE染色显示：ACBP和ACBP/5-Fu组处理细胞24h后，细胞形态出现明显的凋亡特征，如细胞核变小、染色质浓缩、出现凋亡小体等；5-Fu组细胞出现死亡，但凋亡特征少见。③细胞迁移-划痕实验可见，与对照组比较，各组药物作用20h后，均呈现抑制肺癌细胞迁移能力的作用，ACBP和ACBP/5-Fu组作用比5-Fu更显著。④FCM检测发现，经ACBP和ACBP/5-Fu处理细胞24h后，Annexin-V/PI双染结果显示细胞发生的凋亡率较对照组增多(P<0.01)。5-Fu组处理细胞24h后，与对照组比较，除NCI-H226细胞凋亡没变化，其他四株细胞均出现凋亡率增加(P<0.05)。FCM分析各组细胞周期变化显示，作用24h后，各组均显示阻滞细胞周期于G0/G1期的变化。⑤Western-Blot检测发现，与对照组比较，ACBP和ACBP/5-Fu处理细胞24h后，肺癌细胞Gli2蛋白表达降低(P<0.01)，Gli3蛋白表达增加(P<0.01)。5-Fu组处理细胞24h后，与对照组比较，Gli2和Gli3蛋白表达没有变化。⑥荧光定量PCR检测发现，ACBP和ACBP/5-Fu组Gli2基因表达降低(P<0.01)，Gli3基因表达增加(P<0.01)，miR-132和miR-212基因表达均降低(P<0.01)。5-Fu组处理细胞24h后，与对照组比较，Gli2、Gli3和miR-132/212基因表达没有变化。　　结论：（1）ACBP对分化不同的人肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞有显著的生长增殖抑制作用。研究证实①ACBP可能抑制人肺癌细胞 hedgehog信号通路之后，诱导其细胞凋亡，阻滞细胞周期于G0/G1期。②ACBP有效抑制肺癌细胞miR-132/212家族的表达，间接作用于肺癌细胞hedgehog信号通路，抑制肺癌细胞转移能力；（2）ACBP与5-Fu联合用药可增加5-Fu对分化不同的人肺癌NCI-H226、NCI-H460、NCI-H1299、A549和A549/DDP细胞的增殖抑制，增加5-Fu抗肿瘤活性。

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