转录因子Spt6的串联SH2结构域识别RNA聚合酶IIC-端结构域磷酸化修饰的结构生物学研究

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RNA聚合酶II(RNAP II)负责了真核细胞中mRNA、microRNA和大多数的snRNA的转录。在转录过程中有大量的转录因子(transcription factors)参与调节转录的各个阶段，RNAPII的C-末端结构域(CTD)是众多转录因子结合的重要区域。RNAPII CTD是由几十个(26至52)YSPTSPS氨基酸序列重复构成，而且它的磷酸化修饰与转录调节密切相关。其主要磷酸化位点Ser2和Ser5在mRNA转录周期中动态变化，在不同时期招募了各种调节因子，比如Spt6就是在转录延伸阶段被Ser2位磷酸化所招募的延伸因子。
　　 Spt6是组蛋白H3:H4的分子伴侣，参与转录后染色质重组装(re-assembly)的，它的功能缺失会导致从基因编码区内部隐含启动子(cryptic promoter)的转录起始，以及mRNA处理和出核转运的功能障碍。Spt6行使其转录调节功能依赖于它和RNAPII CTD的结合，它通过一个非典型的SH2结构域识别了CTD的Ser2磷酸化(Ser2P)；这是第一个被证实能够结合磷酸化丝氨酸而不是磷酸化酪氨酸的SH2结构域，而且它是酿酒酵母中发现的唯一SH2结构域，在进化上可能代表了SH2家族的起源；因此，从分子结构水平阐释它的识别机理和分子进化地位具有重要的意义。本研究报道了Spt6蛋白质中一个全新的SH2结构域，它与已报道的SH2结构域域组成一个串联结构域模块。我们用溶液核磁共振技术和X射线晶体衍射解析了酿酒酵母和人类Spt6串联SH2的结构域的三维结构，研究了串联SH2结构域模块与RNAPII CTD的结合。
　　第1章中简略地回顾了RNAPII转录的调节，特别是CTD磷酸化在其中所扮演的角色；同时综述了Spt6蛋白质的相关研究进展，重点介绍了其SH2结构域的相互作用和功能。
　　第2章详细描述了酿酒酵母Spt6蛋白质串联SH2结构域的结构与功能研究。通过异核多维核磁共振，我们解析了它在溶液中的三维结构；发现两个串联的SH2结构域形成一个棒状的整体结构，两个结构域之间存在一个保守的疏水核心；主链酰胺基团的纵向、横向弛豫时间(T1、T2)和异核[15N-1H]-NOE数据表明两个SH2结构域与结构域之间的连接区域都具有一样的动力学性质，同时残留偶极耦合(RDC)数据的分析也表明两个SH2结构域在溶液中具有相同的取向(orientation)。化学位移扰动实验证明串联SH2结构域可以结合多种磷酸化状态的CTD多肽，包括Ser2P、Ser5P、Ser2PSer5P和Tyr1P，而且磷酸化多肽的结合位点都位于第一个SH2结构域(SH2N)的同一区域中，而第二个结构域(SH2C)则没有直接参与相互作用。GST pull-down实验也表明Spt6的串联SH2结构域可以和细胞裂解液中的RNAPII结合。我们从结构上分析了SH2N既能结合磷酸化丝氨酸，又能结合磷酸化酪氨酸的分子机制。SH2C的分子进化分析表明它是一类新的SH2结构域亚家族，而且和SH2N形成一个保守的且不可分割的结构模块，存在而且只存在于真核生物Spt6蛋白质中。
　　第3章叙述了人类Spt6蛋白质串联SH2结构域的X射线晶体学研究。我们用蛋白质单晶收集了X射线衍射数据，进一步用硒代晶体的单波长反常散射(MAD)获得了相位信息，解析了2.3 ?的晶体结构。结构表明人类Spt6串联SH2结构域与酿酒酵母有所不同，它的第一个结构域SH2N的bE-bF区域发生了结构域交换(domain-swapping)，形成同二聚；但是同一个单体分子的两个串联SH2结构域的相对取向和堆积与酿酒酵母一样，表明这是一个结构保守的模块。凝胶过滤、分析型超速离心实验和共表达实验表明在溶液中人类串联SH2结构域确实主要以二体形成存在。GST pull-down实验同样表明人类Spt6的串联SH2结构域可以结合细胞裂解液中的RNAP II。
　　第4章描述了RNAPII CTD及其Ser2位点的激酶pTEFb复合物的表达纯化。同过共表达，我们用大肠杆菌成功表达了人类Cdk9(2-330)和cyclin T1(1-272)片段的复合物。另外我们尝试了自行表达酿酒酵母和人类RNAPII的CTD片段，但是没有成功，后来从其他研究组索取了小鼠CTD的表达质粒，获得了CTD重组蛋白质。
　　在本研究中，我们用不同方法解析了酿酒酵母和人类Spt6的串联SH2结构域的三维结构，发现了一个存在于Spt6蛋白质中新的SH2亚家族；滴定实验还发现SH2N不仅结合磷酸化丝氨酸，也结合磷酸化酪氨酸，分子的三维结构很好的解释了它的底物多样性，同时它与不同底物的亲和力也很好的支持了Spt6在转录区域相对丰度的不同。我们发现了人类Spt6 SH2N的存在结构域交换现象，而且进一步证明了在溶液中人类Spt6的串联SH2结构域也主要以二体形似存在，但是这中结构域交换在全长Spt6蛋白质中的意义有待进一步研究。

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作者
刘建平;
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作者单位

中国科学技术大学;

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授予单位中国科学技术大学;
学科结构生物学
授予学位博士
导师姓名施蕴渝,吴季辉;
年度 2010
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类生物结构理论;
关键词
转录因子Spt6; C-末端结构域; SH2结构域; 磷酸化修饰; 结构生物学;

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