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白细胞介素15负调节NKT细胞并抑制NKT细胞介导的肝炎

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综述NKT细胞的研究进展

第二部分白细胞介素15负调节NKT细胞并抑制NKT细胞介导的肝炎

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白细胞介素15负调节NKT细胞并抑制NKT细胞介导的肝炎中国科学技术大学生命科学学院博士研究生李博峰导师田志刚教授NKT细胞是T淋巴细胞的一类亚群，同时表达T淋巴细胞的表面标志TCR和NK细胞的表面标志NK1.1。NKT细胞的TCR不识别MHCⅠ类/Ⅱ类分子递呈的抗原肽，可识别通过CD1d分子递呈的糖脂类分子。NKT细胞的突出标志为快速分泌多种细胞因子(IL-4、IL-5、IFN-γ、TNF-α、IL-10和IL-13等)，提示NKT细胞在天然(固有)免疫应答和免疫调节中扮演着重要的角色。研究NKT细胞与疾病(自身免疫性疾病、癌症等)之间的关系成为免疫学的一个热点领域：NKT细胞在糖尿病，脑脊髓炎，系统性红斑狼疮，动脉粥样硬化，自身免疫性肝炎等多种自身免疫性疾病的形成中扮演着重要角色。 刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)，是从刀豆中提取的植物凝集素，能广泛的刺激淋巴细胞和单核细胞。1992年，TiegsG等人发现通过尾静脉注射ConA，可以诱导小鼠产生暴发性肝炎并造成严重的肝脏损伤。2000年，OkumuraK和TaniguchiM等证实，在ConA诱导的自身免疫性肝炎中，NKT细胞起着决定性的作用。在缺少了NKT细胞的CDld缺陷鼠中，ConA无法诱导肝脏损伤；把野生型小鼠肝脏的NKT细胞过继转输到缺陷鼠中，小鼠肝脏则出现严重的损伤。此外，NKT细胞通过自分泌的细胞因子IL-4增强自身对肝细胞的攻击，是引起肝脏损伤的一个可能机制。随后LouisH等发现NKT细胞分泌的IL-5可以招募嗜酸性粒细胞浸润到肝脏，嗜酸性粒细胞通过分泌一系列有害物质造成肝脏的损伤。BinGao等还发现在ConA模型中，STATl信号活化CD4阳性T细胞和NKT细胞，加速它们对肝细胞的杀伤；而STAT3信号则通过抑制IFN-γ信号转导途径和诱导抗凋亡蛋白Bcl-XL表达，保护肝脏免于损伤。 白细胞介素15是四α-螺旋细胞因子家族成员，在机体天然免疫中占有十分重要的地位。IL-15受体复合物由α、β和γ三条链组成：α链是IL-15特异性的高亲和力受体，β和γ链是与IL-2共用的中等亲和力受体。IL-15和它的受体复合物结合，激活Jak1和Jak3，使STAT3和STAT5磷酸化，启动下游信号通路。虽然IL-15和IL-2有多种相似的特性，但是两者的功能不尽相同。IL-2仅能由活化的T细胞分泌，而IL-15能由多种细胞分泌，并能对诸如淋巴细胞和上皮细胞等多种类型的细胞起作用。然而一方面肝细胞是否表达IL-15受体系统至今仍不清楚。另一方面，IL-15是一种在NKT细胞的发育、生长和动态平衡过程中不可缺少的细胞因子，在IL-15以及IL-15受体β链(IL-15Rβ，CD122)或者γ链(IL-15Rγ，CD132)缺陷的小鼠中，胸腺NKT细胞的数量明显下降。因此，以ConA诱导的自身免疫性肝炎为模型，观察IL-15对NKT细胞的调节作用对于肝脏免疫学和肝脏的免疫病理学有较大的学术意义。 研究目的：基于上述两点考虑，本文的研究目的之一是了解IL-15在ConA诱导的NKT细胞介导的肝炎模型中所发挥的作用。本文研究目的之二是对IL-15和NKT细胞相互作用的细胞生物学研究提出新观点，并且以此为基础对自身免疫性肝炎的免疫治疗提出一种新的治疗方案。 材料和方法：ConA尾静脉注射可以引起小鼠的急性肝脏损伤。在ConA注射前6小时给小鼠注射20微克IL-15，在ConA注射后不同时间点收集各种标本。使用赖氏法检测小鼠血清转氨酶水平。肝脏组织固定后作石蜡切片，进行H&E染色和TUNEL实验。用胶原酶消化法分离肝细胞，标记Annexin-V以及抗IL-15受体的抗体。用抗小鼠的CD3、CD4、CD8、NK1.1、IL-4和IL-5的抗体清除相应的细胞和细胞因子。用ASGM1抗体特异性清除NK细胞后，分离肝脏淋巴细胞并用FITC-anti-NK1.1抗体进行标记，用MACS技术分离纯化得到NKT细胞，进行过继转输实验。用ELISA法检测血清中IL-4、IL-5、TNF-α和IFN-γ的含量；用胞内细胞因子染色方法及FACS技术检测NKT细胞分泌IL-4、IL-5、TNF-α和IFN-γ的能力。用EPO实验检测嗜酸性粒细胞在肝脏中的浸润情况。用RT-PCR的方法检测Eotaxin-1、Eotaxin-2、Eotaxin-3、IL-4和IL-5的mRNA表达水平。用免疫组化的方法检测CCR3的表达，用Westernblotting的方法检测肝细胞上Fas蛋白的表达情况，同时用流式细胞术检测NKT细胞表面FasL的表达。 研究结果：一IL-15抑制ConA诱导的肝脏损伤 在ConA注射前6小时提前注射IL-15抑制了ConA诱导的肝损伤，并且这种抑制作用是IL-15剂量依赖性的。小鼠在ConA注射24小时后血清的ALT水平达到了5124±425U/L；2微克IL-15预先注射小鼠的ALT水平是4906±792U/L，这个剂量基本没有保护作用；而注射10微克的IL-15其ALT水平是2365±347U/L具有一定的保护作用；注射20或者40微克IL-15其ALT水平分别为1362±234U/L和1010±137U/L，可以极大程度的保护小鼠肝脏，可见随着IL-15注射剂量的升高，其抑制肝脏损伤的作用显著提高。另外，在ConA诱导的整个肝脏损伤进程中，IL-15预处理组的ALT值都远低于ConA单独注射组。在给小鼠注射致死剂量的ConA后，80％注射了IL-15的小鼠存活下来，而对照组的所有小鼠在12小时内全部死亡。根据病理学分析，IL-15能减少ConA引起的肝脏大面积坏死和肝细胞凋亡。 二IL-15对肝脏的保护作用依赖于NKI细胞 我们通过实验证实，肝细胞表面没有IL-15受体的表达，因此IL-15和肝细胞没有直接作用。与ConA单独注射组相比，IL-15预处理组的肝脏T、NKT和NK细胞在数量上没有明显变化。通过细胞清除实验，我们证明IL-15对肝脏的保护作用不是通过NK细胞或者CD8阳性的T细胞实现的。清除小鼠体内NKT细胞，ConA无法诱导肝脏损伤；将NKT细胞重新转输到这些被清除了NKT细胞的小鼠体内，ConA所诱导的严重肝脏损伤又会重现，其ALT值为5246±249U/L；使用经过体内或者体外IL-15刺激的NKT细胞进行过继转输，其转输后小鼠血清ALT值分别为823±75U/L和914±183U/L，极大程度地降低了肝脏损伤。我们在缺失了NKT细胞的CD1d基因缺陷鼠中得到了非常相似的实验结果。上述结果表明，IL-15对ConA诱导的肝炎的保护作用是依赖于NKT细胞的。 三IL-15抑制NKT分泌细胞因子并减少嗜酸性粒细胞向肝脏浸润 清除小鼠体内的IL-4或者IL-5，小鼠肝脏内嗜酸性粒细胞的数量显著减少。通过ELISA实验，我们证明IL-15预先注射导致ConA注射后2小时和3小时小鼠血清中IL-4含量下降了30％和50％；ConA注射后3小时、6小时和12小时小鼠血清中IL-5含量下降了50％以上。通过胞内细胞因子检测，我们进一步证明IL-15可以抑制NKT细胞分泌IL-4、IL-5和TNF-α的能力。利用EPO实验，我们确认IL-15预先注射能够大幅度降低浸润到肝脏的嗜酸性粒细胞数目。上述结果表明，IL-15通过下调NKT细胞产生的IL-4和IL-5水平，抑制嗜酸性粒细胞对肝脏的浸润。 四IL-15减少NKT细胞表面FasL和肝细胞表面Fas的表达 NKT细胞能够利用表面的.FasL蛋白直接结合肝细胞表面的Fas蛋白，从而杀伤肝细胞。我们观察到在ConA注射后1小时，NKT细胞就迅速上调其表面FasL表达，而IL-15预先注射可以降低NKT细胞的.FasL表达。同时，我们还用流式细胞术和Westernblotting证明IL-15可以降低肝细胞表面Fas蛋白的表达水平。 结论和意义： 综上所述，我们首次发现在ConA诱导的肝炎模型中，预先注射IL-15可以降低ConA诱导的小鼠死亡率，抑制其血清ALT水平的升高，减少肝脏大面积坏死和肝细胞凋亡，证明IL-15具有抑制ConA诱导的暴发性肝炎的能力。IL-15的保护机制是：通过直接抑制NKT细胞分泌IL-4、IL-5和TNF-α，减少嗜酸性粒细胞的浸润和降低NKT细胞表面FasL的表达。由此可见，IL-15对于治疗人类的自身免疫性肝炎具有潜在的临床应用价值。

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