基于靶向肽的强化融合蛋白和化学偶联物的制备与抗肿瘤作用研究

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小型化、高效化是靶向抗肿瘤药物的发展趋势，与抗体及其片段相比，靶向肽具有分子量更小、免疫原性更弱的优点。本文的第一部分，通过基因工程的方法制备CD13靶向肽NGR(Asn-Gly-Arg)与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白，再通过分子强化技术组装发色团，得到有活性的强化融合蛋白，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。第二部分，通过化学方法合成抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)与云南霉素(yaannanycin，YNM)的偶联物，并研究其抗肿瘤活性。 1．CD13靶向肽与力达霉素强化融合蛋白的制备及抗肿瘤活性NGR-CD13是良好的肿瘤新生血管靶向系统，NGR序列与肿瘤血管内皮细胞表达的CD13异构体特异结合。力达霉素(lidamycin，LDM，又叫C1027)是大分子肽类抗肿瘤抗生素，由辅基蛋白(lidaprotein，LDP)和活性烯二炔发色团(active enediyne，AE)构成，发色团具有很强的细胞毒作用但不稳定，辅基蛋白对发色团起保护作用。LDP和AE以非共价键结合，可以拆分和重建，重建后的蛋白具有同样的细胞毒作用，这为体外LDP融合蛋白与AE的分子重建提供了基础。本研究先通过基因工程的方法制备NGR肽与LDP的融合蛋白，再通过分子强化组装发色团，得到有活性的强化融合蛋白，并对其体内外抗肿瘤活性进行研究。体内实验采用昆明小鼠皮下移植性肝癌H22模型，分别于接种后3天和10天尾静脉注射给药两次。实验结果表明：强化融合蛋白对肿瘤的生长有强烈的抑制作用，实验第16天0.2 mg/kg、0.4 mg/kg和0.8 mg/kg三个剂量组的NGR-LDP-AE抑瘤率分别为59.8％、77.8％和94.8％，0.05 mg/kg的游离力达霉素(耐受剂量)抑瘤率为66.9％，未经强化的融合蛋白NGR-LDP基本无抑瘤作用。治疗期间动物体重没有减轻，没有观察到其它明显的毒副作用，表明所用剂量为可耐受剂量。 2.云南霉素与抗黏附肽RGD偶联物的合成及其抗肿瘤活性抗黏附肽RGD(Arg-Gly-Asp)的受体是细胞表面的整合素(integrin)，通过制备RGD与云南霉素的偶联物，使终产物既具备RGD肽抗黏附的功能，又具有云南霉素杀伤细胞的能力。云南霉素的羟基、氨基用叔丁氧甲酰基(Boc)保护，RGD的羧基用甲酯基(0pMe)保护；以2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)为缩合剂，使云南霉素的羧基与RGD的氨基缩合得到偶联物；薄层层析(TLC)监测反应进程。利用硅胶制备板对产物进行分离纯化。质谱分析发现终产物终含有分子量分别为773 Da、801 Da和901 Da的成份，分别对应于YNM-RGD、YNM-RGD(OMe)<,2>和YNM(Boc)-RGD(OMe)<,2>；HPLC分析三种化合物的总含量为87.16％。MTT显示偶联物和云南霉素对PG细胞的.IC<,50>值分别为0.129 mM和0.01 mM，对Bel-7402细胞的IC<,50>值为0.135 mM和0.029mM，0.1 mM的RGD对两种细胞均无明显的细胞毒作用；1 mM时偶联物、云南霉素和RGD对PG细胞的抑制率分别为73.1％、91.8％和16.9％。Boyden chamber显示0.1 mM时偶联物和RGD对PG细胞跨膜的抑制率分别为50.9％和40.8％；0.2 mM时为66.4％和56.2％；0.4mM时为66.6％和57.1％；0.1 mM的云南霉素对PG的细胞跨膜能力无明显影响。偶联物兼有云南霉素和RGD的生物活性；与云南霉素相比，偶联物的细胞毒作用下降，但与RGD相比仍有较强的细胞毒作用；YNM-RGD在体外具有抗侵袭的能力，其作用与浓度呈依赖关系。

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作者
郑艳波;
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作者单位

北京协和医学院;

中国医学科学院;

清华大学医学部;

中国协和医科大学;

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授予单位北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;中国协和医科大学;
学科微生物与生化药学
授予学位博士
导师姓名甄永苏;
年度 2007
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类抗肿瘤、抗癌药物;
关键词
抗肿瘤药物; 靶向肽; 融合蛋白; 化学偶联物; 药物制备; 抗肿瘤作用;

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