睡美人转座子在草鱼CIK细胞中介导的高效基因整合

陈凯; 薛亭; 王艺舟; 潘启华; 于淼; 陈天圣

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睡美人转座子在草鱼CIK细胞中介导的高效基因整合

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为研究睡美人(Sleeping Beauty,SB)转座子系统在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾脏细胞(CIK)中介导的整合特性,构建了SB转座子和转座酶在两个质粒的二元反式(trans)转座子系统,以及转座子和转座酶元件在同一个质粒的一元顺式(cis)转座子系统;通过转染CIK细胞,用荧光显微镜、流式细胞仪和荧光定量PCR分析了转染2d后及嘌呤霉素筛选4周后的细胞,测定DsRed转染效率和整合效率,并结合高效热不对称交互式PCR扩增获得SB转座子整合位点的序列.结果表明, SB二元转座子系统的整合效率远高于一元系统; SB转座子与转座酶比例为1:2时,外源基因DsRed的整合效率最高;SB转座子偏向于插入草鱼基因组TA序列处.研究表明优化SB转座子和转座酶的比例能提高外源基因在草鱼细胞中的整合效率并快速获得突变细胞, 同时为在鱼类细胞中采用SB转座子建立突变体文库提供理论基础.%In this study,the features of SB-mediated integration were examined in grass carp(Ctenopharyngodon idel-lus)kidney cells(CIK).Two expression systems were constructed:the transposase and transposon reporters were sepa-rated into two vectors designated as SB trans-configuration(trans)system,whereas the transposase and transposon cas-settes were combined in one vector named as SB cis-configuration(cis)system.The vectors were transfected into CIK cells,and then the transfection and integration efficiency of DsRed were investigated by fluorescence microscope,flow cytometry, and quantitative RT-PCR after 2 days or 4 weeks of puromycin selection. In addition, the unknown se-quences within the integration regions were also characterized by hiTAIL-PCR. The results showed that the integration efficiency of SB trans system was much higher than the cis system;the highest integration efficiency of DsRed was ob-served when the ratio of transposon versus transposase was 1:2; the transposon was inserted randomly into TA dinuc-leotides with preference. In conclusion, this study demonstrated that optimizing the ratio of SB transposon versus trans-posase increased the exogenous gene integration efficiency and generated mutant cells rapidly.

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来源
《水生生物学报》|2018年第2期|264-270|共7页
作者
陈凯; 薛亭; 王艺舟; 潘启华; 于淼; 陈天圣;
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作者单位

华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070;

华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070;

华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070;

华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070;

华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070;

河南师范大学水产学院, 河南省水产动物养殖工程技术研究中心, 新乡 453007;

华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类鱼苗、鱼种的获得;水生生物遗传学;
关键词
睡美人转座子; 转座酶; 草鱼肾脏细胞; 整合位点;

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