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利用CRISPR/Cas9系统建立斑马鱼Spag6基因敲除模型

         
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摘要

Objective To establish a sperm-associated antigen 6(Spag6)gene knockout zebrafish model using CRISPR/Cas9 technology,an efficient gene editing system.Methods The Spag6-targeting regions were chosen by bioinformatics analysis and the gRNA expression vectors established and transcribed in vitro.Approximately 1 nL of Cas9 RNA and gRNA mixture was co-injected into each yolk of one-cell stage embryo.Genomic DNA was extracted after 24 -48 h,and the target fragment was amplified by PCR.Editing effect was evaluated by digestion of the PCR products and DNA sequencing.Results Three gRNAs were synthesized(named S1,S2,S3),and the two with higher concentrations(S1 and S3)were injected.Restriction enzyme diges-tion and DNA sequencing revealed that the Spag6 gene was successfully edited by S3.Conclusion Spag6 gene of zebrafish was successfully edited by CRISPR/Cas9 system,which provides a basis for further study of Spag6 gene in vivo.%目的 采用高效基因编辑系统CRISPR/Cas9对斑马鱼的精子相关抗原6(Spag6)基因进行编辑,建立Spag6基因敲除斑马鱼模型.方法 针对斑马鱼Spag6基因,利用生物信息学选取靶位点,构建向导RNA(gRNA)表达载体并体外转录,将gRNA和Cas9 mRNA混合物显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中,24~48 h提取基因组DNA,PCR扩增出目的片段,限制性酶切法初步检测基因打靶情况,最后进行测序分析确定编辑效果.结果 取3个靶位点(S1、S2、S3)进行实验,选择gRNA浓度较高的S1和S3进行注射.限制性酶切及测序的结果显示S3已产生编辑效应.结论 通过CRISPR/Cas9系统成功地获得Spag6基因编辑的突变体,为进一步探讨斑马鱼Spag6基因的体内功能奠定了基础.

著录项

  • 来源
    《华中科技大学学报（医学版）》 |2018年第2期|198-202|共5页
  • 作者

    张世阳; 张志兵; 镇景开; Megan Hept; 李 为; James A.Lister; 张 玲; 曾婧;

  • 作者单位

    武汉科技大学医学院公共卫生学院,武汉 430065;

    美国弗吉尼亚联邦大学妇产科,里士满 23298;

    武汉科技大学医学院职业危害识别与控制湖北省重点实验室,武汉 430065;

    武汉科技大学医学院公共卫生学院,武汉 430065;

    美国弗吉尼亚联邦大学妇产科,里士满 23298;

    武汉科技大学医学院公共卫生学院,武汉 430065;

    武汉科技大学医学院职业危害识别与控制湖北省重点实验室,武汉 430065;

    美国弗吉尼亚联邦大学人类和分子遗传学系,里士满 23298;

    美国弗吉尼亚联邦大学妇产科,里士满 23298;

    美国弗吉尼亚联邦大学人类和分子遗传学系,里士满 23298;

    武汉科技大学医学院公共卫生学院,武汉 430065;

    武汉科技大学医学院职业危害识别与控制湖北省重点实验室,武汉 430065;

    武汉科技大学医学院公共卫生学院,武汉 430065;

    美国弗吉尼亚联邦大学妇产科,里士满 23298;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 男性不育症;
  • 关键词

    CRISPR/Cas9; Spag6; 斑马鱼; 基因编辑;

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