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利用增强型绿色荧光蛋白研究不同启动子在乳酸克鲁维酵母中的功能

         
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以增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)为报告基因评价不同启动子在乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中的转录功能,寻找高效表达外源蛋白的启动子.以改造后载体pKLAC1*为基础,PCR克隆来源于K.lactis、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和Spathaspora passalidarum中7个不同的启动子,采用重叠延伸PCR分别与egfp融合后插入pKLAC1*,Bst XI线性化重组表达载体后电转化K.lactis GG799获得重组菌,利用特异性引物PCR扩增法快速筛选获得不同启动子调控下的单拷贝整合重组菌,通过定性和定量分析绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,比较不同启动子的转录活性.荧光显微镜观察结果表明,K.lactis来源的pKladh4、pKlmal22,S.cerevisiae来源的pScgal7、pScgpd1,S.passalidarum来源的pSpmal1、pSpmal6、pSpgal1均成功调控EGFP的表达.荧光分光光度计定量测定结果表明,重组菌在pKladh4、pScgal7、pScgpd1调控下荧光强度分别为2.82、2.92和4.74,且在相应的诱导条件下转录能力分别提高了13%、57%和22%,均高于当前应用最广泛的强启动子pKllac4(荧光强度为2.13).探究了不同来源启动子在K.lactis中的功能,pKladh4、pScgal7、pScgpd1具有高效起始转录能力,其中pScgpd1在K.lactis中的应用为首次报道.%In order to seek the promoters efficiently expressing heterologous protein,the transcription functions of different promoters were evaluated using Enhanced Green Fluorescent Protein gene(egfp)as a reporter gene in Kluyveromyces lactis. Seven different promoters from K. lactis,Saccharomyces cerevisiae and Spathaspora passalidarum were cloned by PCR,fused to egfp respectively by overlap extension PCR and cloned into the reformed vector pKLAC1*. The recombinant expression plasmids were linearized by Bst XI and electro-transformed into K. lactis GG799. Further,the single-copy integrated recombinants regulated by different promoters were screened by PCR with specific primers,and the functions of different promoters were compared after qualitative and quantitative analysis of EGFP. The results of fluorescence microscopy showed that the expression of EGFP was regulated by the pKladh4 and pKlmal22 from K. lactis,pScgal7 and pScgpd1 from S. cerevisiae,as well as pSpmal1,pSpmal6 and pSpgal1 from S. passalidarum. The quantitative results of fluorospectrophotometer revealed that the fluorescence intensity of EGFP regulated by pKladh4,pScgal7 and pScgpd1 was 2.82,2.92 and 4.74,respectively ;moreover,under the condition of the corresponding induction,the expression of EGFP was improved 13%,57% and 22%,respectively. These promoters were much stronger than pKllac4(2.13)that was the most widely used currently. Conclusively,this work probed the functions of promoters from different organisms in K. lactis,and the pKladh4,pScgal7 and pScgpd1 presented efficient initial transcription. It is the first time to report the application of pScgpd1 in K. lactis.

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  • 来源
    《生物技术通报》 |2017年第6期|197-206|共10页
  • 作者

    孙海烨; 张梁; 李由然; 顾正华; 丁重阳; 石贵阳;

  • 作者单位

    江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122;

    江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122;

    江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122;

    江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122;

    江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122;

    江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122;

    江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122;

    江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室,无锡 214122;

    江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类
  • 关键词

    乳酸克鲁维酵母; 启动子; 增强型绿色荧光蛋白; 单拷贝整合; 荧光强度;

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