单增李斯特菌核糖核酸酶Rnase Ⅲ RncS氨基酸突变对其降解RNA活性的影响

王立霞; 孟庆玲; 乔军; 蔡扩军; 王登峰; 伍晔晖; 郭晶; 才学鹏

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为研究单增李斯特菌(LM)核糖核酸酶RnaseⅢRncS氨基酸突变对RNA降解活性的影响.利用生物信息学软件分析单核细胞增生李斯特菌(LM)野毒株SB5中rncS基因编码的RnaseⅢ的结构域,并选择关键氨基酸利用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对其进行了基因突变;然后将rncS突变基因片段D50A、E122A克隆至表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达;应用SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组蛋白的表达情况及其抗原特异性;通过体外酶活试验研究其对RNA降解活性的影响.结构域分析结果显示,LM-RnaseⅢ氨基酸序列含有1个双链RNA结合结构域(DSRM)和1个核酸酶结构域(RIBOc),其中结构域RIBOc含有5个活性位点.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组突变型RnaseⅢ-D50A和RnaseⅢ-E122 A蛋白相对分子质量均为42.5 kD,与理论值相符;Western blot分析表明重组突变型RnaseⅢ-1)50A和RnaseⅢ-E122A蛋白可与LM阳性血清发生免疫学反应.体外酶活实验表明,RnaseⅢ发挥降解活性依赖于Mn2+或Mg2+,将其第50位天冬氨酸突变后,RnaseⅢRncS的降解活性有所降低(P＜0.001);第122位谷氨酸突变后,RnaseⅢRncS降解活性极显著下降(P＜0.0001),提示第122位谷氨酸是维持LM RnaseⅢRncS酶活性的关键位点.

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来源
《生物技术通报》 |2019年第3期|110-116|共7页
作者
王立霞; 孟庆玲; 乔军; 蔡扩军; 王登峰; 伍晔晖; 郭晶; 才学鹏;
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作者单位

石河子大学动物科技学院,石河子832003;

石河子大学动物科技学院,石河子832003;

石河子大学动物科技学院,石河子832003;

乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心,乌鲁木齐830063;

新疆畜牧科学院兽医研究所,乌鲁木齐830000;

石河子大学动物科技学院,石河子832003;

石河子大学动物科技学院,石河子832003;

中国农业科学院兰州兽医研究所,兰州730046;

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正文语种 chi
中图分类
关键词
单核细胞增生李斯特菌; 核糖核酸酶RnaseⅢ; rncS基因; 降解活性;

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