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美洲大蠊抗肝纤维化活性部位酶解制备工艺的水解蛋白酶筛选

         
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cqvip:目的:优选美洲大蠊脱脂膏酶解工艺的最佳水解酶,以提高美洲大蠊中抗肝纤维化活性部位的提取得率和活性。方法:以美洲大蠊脱脂膏为对照,采用茚三酮法和福林酚法考察胰蛋白酶(TR)、胃蛋白酶(PE)、碱性蛋白酶(AL)、木瓜蛋白酶(PA)、中性蛋白酶(NE)对脱脂膏的水解度;采用大孔树脂分离纯化法,分别以50%、60%、70%、95%乙醇为洗脱溶剂,考察各酶解液不同溶剂洗脱部位的得率;借助大鼠肝星状细胞HSC-T6体外抑制试验,考察各酶解液洗脱部位的抗肝纤维化活性。结果:PA、NE对美洲大蠊脱脂膏的水解度分别为14.15%、15.70%,具有较强的酶解能力。PA、NE、AL酶解液的95%乙醇洗脱部位得率分别为(0.73±0.04)%、(0.65±0.01)%、(0.64±0.05)%,分别较不加酶的脱脂膏提高了30.36%、16.07%、14.29%。细胞体外抑制试验结果显示,各酶解液分离纯化所得的50%、60%、70%乙醇洗脱部位对HSC-T6细胞抑制率较低或呈现促增长现象;其95%乙醇洗脱部位对HSC-T6细胞的抑制率总体均在20%以上,其中PA、NE酶解液分离纯化所得的95%乙醇洗脱部位作用24~72h时的半数抑制浓度(IC50)分别为94.5~112.3、117.1~120.0μg/mL,总体小于不加酶的脱脂膏的IC5( 0 116.1~123.0μg/mL)。结论:综合水解度、纯化洗脱部位得率及对HSC-T6细胞的体外抑制活性3个指标,确定PA为美洲大蠊脱脂膏抗肝纤维化活性部位酶解工艺的最佳水解酶;NE、AL效果次之;PE、TR效果较差,不适于该酶解工艺。

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