尿激酶原在培养上清液中稳定性的研究

杨波; 李天德; 陈练; 王广义; 王玉堂; 盖鲁粤

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尿激酶原在培养上清液中稳定性的研究

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目的: 探讨尿激酶原糖基化对其表达稳定性的影响.方法: 将302位天冬酰胺(Asn302)突变为丙氨酸(Ala302),构建非糖基化尿激酶原.用基因重组的方法将重组尿激酶原和天然尿激酶原转染至dh-CHO细胞(二氢叶酸还原酶缺陷型--中国仓鼠卵巢细胞)中培养.收取无血清培养上清为检测标本.用嗜热杆菌的金属蛋白酶(thermolysin)激活尿激酶原.用抑肽酶(aprotinin)终止激活反应.生色底物S-2444用于显色反应.在405nm波长处测定OD值(分光光度值)以确定双链成分的比例.在不用thermolysin激活的条件下,用公式计算单链尿激酶原比例.将重组尿激酶原和天然尿激酶原的培养上清液置于4℃和37℃.每隔12 h测定总活性和单链成分比例.经过阳离子层析和凝胶层析纯化后,测定蛋白产品浓度、活性.以SDS-PAGE电泳鉴定蛋白质分子量和蛋白含量.结果: 在37℃下天然尿激酸原(糖基化)的活性远高于重组尿激酶原(非糖基化).无论4℃或37℃,糖基化尿激酶原的单链比例均高于非糖基化尿激酶原.纯化后的天然尿激酶原蛋白产品浓度和活性均高于重组尿激酶原.SDS-PAGE电泳结果提示天然尿激酶原浓度高于重组尿激酶原,分子量低于重组尿激酶原.结论: 较高的温度加速原激酶原降解.Asn302位的糖基化位点有益于尿激酶原在培养上清液中的稳定性.

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来源
《心血管康复医学杂志》 |2006年第5期|471-475|共5页
作者
杨波; 李天德; 陈练; 王广义; 王玉堂; 盖鲁粤;
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作者单位

解放军总医院心内科,北京市,100853;

西藏军区总医院心内科,拉萨市,西藏,850007;

解放军总医院心内科,北京市,100853;

解放军总医院心内科,北京市,100853;

解放军总医院心内科,北京市,100853;

解放军总医院心内科,北京市,100853;

解放军总医院心内科,北京市,100853;

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正文语种 chi
中图分类 R446.1209;
关键词
酶稳定性; 尿纤溶酶原激活物; 糖基化;

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