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人脐带间充质干细胞源性小细胞外囊泡静脉注射对小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

         
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目的探讨静脉注射人脐带间充质干细胞(MSCs)源性小细胞外囊泡(sEVs)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠的治疗作用。方法分离并培养人脐带MSCs,收集细胞培养上清液,采用超速离心法分离MSCs源性sEVs。采用Nanosight分析sEVs粒径,透射电子显微镜下鉴定sEVs形态;采用Western blot法检测sEVs表面标志物CD9、CD81和CD63蛋白的表达。取48只SPF级7周龄C57BL/6雌性小鼠,采用光感受器间维生素A类结合蛋白651-670(IRBP_(651-670))注射法制备EAU模型。采用随机数字表法将模型小鼠随机分为sEVs治疗组和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组,每组24只。sEVs治疗组小鼠于EAU造模后第11天尾静脉注射MSCs源性sEVs 50μg,PBS对照组以同样方法注射同体积PBS。造模后第8天各组分别随机选取6只小鼠扩瞳后检眼镜下观察眼底炎症情况,隔日1次,并进行炎症评分。造模后第18天采用颈椎脱臼法各组处死6只小鼠,立即摘取双眼眼球制作眼球石蜡切片并行苏木精-伊红染色,进行眼底病理炎症评分。各组分别随机选取6只小鼠,于造模后第18天颈椎脱臼法处死,立即摘取双眼眼球,采用流式细胞术检测小鼠眼球组织中辅助性T细胞1(Th1细胞)、Th17细胞浸润情况;于造模后第14天各组分别颈椎脱臼法处死6只小鼠,立即分离脾脏及引流淋巴结中的T细胞,采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法检测终质量浓度为0、1、10和20μg/ml IRBP_(651-670)条件下T细胞增生情况。另选取3只正常小鼠,采用磁珠阴选法分离脾脏初始T细胞,分为sEVs处理组和PBS对照组,根据分组加入10μg/ml的MSCs源性sEVs或等体积PBS进行共孵育,分别在Th1/Th17细胞分化条件下培养,采用流式细胞术检测各组初始T细胞向Th1/Th17细胞分化情况。结果分离的人脐带MSCs源性sEVs直径平均为(102.4±33.6)nm,透射电子显微镜下sEVs呈双层膜囊泡结构,sEVs中CD9、CD63和CD81蛋白呈高表达。造模后14、16、18、20和22 d,sEVs治疗组眼底炎症评分均低于PBS对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。造模后18 d,sEVs治疗组小鼠眼球组织病理评分明显低于PBS对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后18 d,sEVs治疗组小鼠眼球组织中Th1、Th17细胞百分比分别为(15.55±2.03)%和(15.67±2.15)%,明显低于PBS对照组的(21.35±0.72)%和(20.90±1.10)%,差异均有统计学意义(t=6.58、5.31,均P<0.01)。在IRBP_(651-670)质量浓度为20μg/ml条件下,sEVs治疗组T细胞体外增生能力显著低于PBS对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。sEVs处理组初始T细胞分化为Th1细胞和Th17细胞的百分比分别为(28.15±1.32)%和(11.60±2.23)%,明显低于PBS对照组的(31.58±1.75)%和(23.52±1.76)%,差异均有统计学意义(t=3.93、10.26,均P<0.05)。结论尾静脉注射人脐带MSCs源性sEVs可明显减轻EAU小鼠眼底炎性反应,其机制与抑制初始T细胞向Th1和Th17细胞的分化,减少眼球中Th1和Th17细胞浸润有关。

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