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首页> 中文期刊> 《中华肝脏病杂志》 >脱氧核酶对丙型肝炎病毒RNA的剪切活性

脱氧核酶对丙型肝炎病毒RNA的剪切活性

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目的观察丙型肝炎病毒(HCV)RNA特异性脱氧核酶的体外剪切活性,探讨其用于抗病毒基因调控的可能性.方法以HCV 5-非编码区及部分C区(5'-NCR-C)中两个具有5'…A ↓ U…3'特征的序列为靶位,以5'GGCTAGCTACAACGA 3'为活性中心,设计并合成两端经硫代修饰的脱氧核酶(TDRz),即TDRz-127和TDRzl.用Nar I将质粒pHCV-neo完全线性化后,以之为模板体外转录获取HCV 5'-NCR-C;用碱性磷酸酶去除其5'端磷酸,再用T4聚核苷酸激酶和γ-32P-ATP进行5'端放射性标记.在pH7.5、Mg2+10 mmol/L等条件下,将两种TDRz分别(5μmol/L)或共同(各2.5μmol/L)与底物RNA(200 nmol/L)混合,经变性、复性后于3 7℃孵育,分别于不同的时间点取出等份终止反应.以8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分离、显示剪切产物,在凝胶成像分析仪上分析各条带光密度值并计算剪切百分率.结果在所设常用反应条件下于 37℃孵育15、30、45、60、75、90min后,TDRz-127的剪切百分率分别达8.3%、16.1%、24.3%、26.2%、29.4%和31.1%,TDRzl的剪切百分率分别达7.4%、13.0%、15.6%、18.7%、19.4%和20.3%,两者同时剪切时的百分率约15.1%、29.6%、37.8%、39.1%、41.5%、42.6%.结论TDRZ-127和TDRzl对HCV 5'NCR-C的剪切百分率随时间延长而升高,两者联合剪切优于单独剪切的效果.

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