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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

         
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p54蛋白是非洲猪瘟病毒(ASFV)进入宿主细胞的重要结构蛋白,参与病毒的早期感染,具有较强的免疫原性,常作为研制非洲猪瘟(ASF)疫苗和检测方法的重要靶点。为制备ASFV p54蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究通过构建重组质粒p ET28a-p54并经原核表达重组p54蛋白(rp54),采用镍柱亲和层析方法对rp54纯化后经SDS-PAGE鉴定。结果显示,rp54主要在沉淀中出现17 ku的目的条带,经纯化效果较好。采用纯化的rp54免疫BALB/c小鼠,三免后采用间接ELISA方法测定小鼠血清的抗体效价。选择抗体效价最高的小鼠冲击免疫,3 d后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过间接ELISA筛选稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞。结果显示,三免后小鼠血清抗体效价最高达1∶256 000,表明该蛋白的免疫原性很好。间接ELISA筛选结果显示,获得了3株稳定分泌p54蛋白MAb的杂交瘤细胞株。分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测该3株MAb的反应原性,采用间接ELISA检测3株MAb的特异性。Western blot结果显示,3株MAb均在17 ku处出现特异性条带;IFA结果显示,以3株MAb作为一抗的表达p54蛋白的HEK293T细胞出现绿色荧光,而未转染质粒的阴性对照细胞无绿色荧光;间接ELISA结果显示,3株MAb仅与p54蛋白反应,而与其它猪源病毒蛋白均无反应。上述结果表明,本研究获得具有良好免疫原性的rp54,并制备了3株p54 MAb,且3株MAb的反应原性及特异性均较强,本研究为开发ASFV的检测技术和开展该病毒的生物学研究提供了生物材料。

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