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食蟹猴神经干细胞的培养与分化

         
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背景:关于神经干细胞以往研究多集中在啮齿类和人类,涉及非人灵长类的神经干细胞研究较少。目的:建立食蟹猴神经干细胞的体外分离培养方法,并观察其分化潜能。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-07/2009-04在中山大学干细胞与组织工程研究中心完成。材料:孕3～5个月的食蟹猴流产胚胎,由蓝岛生物技术有限公司(华南非人灵长类研究开发中心)提供。方法:取食蟹猴胚胎的室管膜下区及海马区脑组织,放入神经干细胞悬浮培养液中,巴氏吸管吹打分散,得到单细胞悬液,调整细胞浓度为(2.0～5.0)×105接种于25cm2培养瓶中,在37℃、体积分数为5%的CO2条件下进行原代悬浮培养。待形成神经球2周后,接种于预先包被多聚鸟氨酸/纤维连接蛋白的培养板上进行贴壁培养。每天向孔内添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子各20μg/L,待细胞增殖到90%左右传代扩增。主要观察指标:利用免疫细胞荧光化学技术,对体外培养的食蟹猴神经干细胞表面标志性抗原nestin及其分化潜能进行鉴定。结果:悬浮培养1周后,倒置显微镜下可见神经球形成,神经球在培养过程中逐渐增大。第4周将神经球进行贴壁培养后,24h可见神经球贴附于板壁,并有突触从球中伸出,随后大量细胞从神经球中迁出,逐渐铺满板壁。添加上皮生长因子和碱性成纤维生长因子培养的神经干细胞呈nestin+,而未添加两种因子的神经干细胞呈GFAP+,Tuj1+,O4+。结论:悬浮培养与贴壁培养相结合的方法较适合食蟹猴神经干细胞的培养及传代,分离出的食蟹猴神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元细胞、少突胶质细胞的能力。

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