HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选

施桥发; 魏晓丽; 李虹; 王保宁; 张卫东; 蒋忠华; 曹康; 李明远

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目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定.方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切的pET32a(+)载体,转染JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测目标蛋白表达情况.将BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pET32(+)/E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3.1(+)空质粒,构建pcDNA3.1(+)/E5真核表达质粒并对NIH3T3细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT-PCR鉴定细胞内HPV16E5基因表达情况.结果成功构建了原核表达质粒pET32/E5,在1 mmol/LIPTG、28℃诱导条件下BL21(DE3)菌体中HPV16 E5-TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10%左右.真核表达质粒pcDNA3.1(+)/E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/ml G418浓度时筛选21d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列.结论成功构建了pET32/E5原核和pcDNA3.1(+)/E5真核表达质粒,HPV16E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达,这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础.

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来源
《南方医科大学学报》 |2006年第1期|31-35|共5页
作者
施桥发; 魏晓丽; 李虹; 王保宁; 张卫东; 蒋忠华; 曹康; 李明远;
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作者单位

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

新疆医科大学基础医学院免疫学教研室,新疆,乌鲁木齐,830054;

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

成都医学院病原生物学教研室,四川,成都,610083;

四川大学华西基础医学与法医学院,微生物学教研室,四川,成都,610041;

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正文语种 chi
中图分类卵巢肿瘤;
关键词
HPV16; 原核表达; SDS-PAGE; 免疫印迹; RT-PCR;

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