目的:建立外标准法SYBR GREEN I实时定量(real-time)RT-PCR方法,以检测豚鼠TSHR分子免疫对BALB/c小鼠甲状腺TSHR mRNA的表达的影响.方法:取正常BALB/c小鼠甲状腺提取甲状腺总RNA,逆转录后进行PCR,得到333 bp扩增产物.经回收纯化后作为real-timePCR的标准品,稀释为106、105、104、103、102、101拷贝,制作标准曲线;并同时进行普通PCR,比较其灵敏度.优化反应条件使溶解曲线有特异扩增.检测豚鼠TSHR分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺TSHR mRNA的表达.结果:建立的外标准法SYBR GREEN I实时定量RT-PCR方法可以灵敏的检测到10 copy的核酸,灵敏度为普通PCR的104倍;溶解曲线只有特异峰,溶解温度为82.9℃.没有明显的引物二聚体和非特异峰出现.不同标准点批间变异系数范围为5.8%～14.3%(n=6).与对照组比较,TSHR大分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺组织TSHR mRNA水平显著升高(P＜0.05).结论:外标准法SYBR GREEN I实时定量RT-PCR具有灵敏度高,特异性强,重复性好的特点,比普通PCR更精确地检测出小鼠甲状腺组织TSHR mRNA的水平.
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