连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座

邵振鲁; 吴晓洁; 林艳丽; 熊福银; 周艳荣; 郑芸芸; 李金钢; 陈红星

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连续3步缺口修复构建小鼠乳清酸蛋白-人溶菌酶杂合基因座

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目的：构建一个利用小鼠乳清酸蛋白(mWAP)基因座完整的上下游调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列在乳腺内特异性高效表达的mWAP-hLYZ杂合基因座，实现人溶菌酶的高效表达。方法：采用连续3步缺口修复的方法。首先，以pBR322载体作为骨架，插入预先合成的6个同源臂序列，构成能够连续进行3次缺口修复的基因抓捕载体。然后在大肠杆菌内利用λ噬菌体Red同源重组系统介导的同源重组方法：第一步，从含mWAP基因座的细菌人工染色体(BAC)上亚克隆8 kb的mWAP基因3'端完整侧翼序列到抓捕载体上；第二步，从含hLYZ基因的BAC上亚克隆5 kb的从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)的hLYZ基因组序列；第三步，从mWAP BAC上亚克隆9 kb的mWAP基因5'端完整侧翼序列，并使上述3个片段在抓捕载体上自动无痕地连接在一起。结果：构建了全长约22 kb的mWAP-hLYZ杂合基因座，经PCR扩增、限制性内切酶酶切和序列测定验证，构建的杂合基因座达到原mWAP基因座中mWAP基因组编码序列从起始密码子(ATG)到终止密码子(TAA)完全被hLYZ基因组序列精确置换的目的。结论：通过连续3步缺口修复构建杂合mWAP-hLYZ基因座乳腺表达载体，为乳腺生物反应器高效表达人溶菌酶提供了可行的思路和方法。%10.3969/j.issn.1009-0002.2012.05.005

著录项

来源
《生物技术通讯》 |2012年第5期|648-652657|共6页
作者
邵振鲁; 吴晓洁; 林艳丽; 熊福银; 周艳荣; 郑芸芸; 李金钢; 陈红星;
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作者单位

陕西师范大学生命科学学院,陕西西安 710062;

军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;

军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;

军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;

军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;

陕西师范大学生命科学学院,陕西西安 710062;

陕西师范大学生命科学学院,陕西西安 710062;

军事医学科学院生物工程研究所,北京 100071;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类基因工程（遗传工程）;
关键词
细菌人工染色体; 缺口修复; 乳清酸蛋白; 人溶菌酶;

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