dNTPs加入一定比例Cy5-dATP可以扩增荧光Cy5DNA,用于T5外切酶(T5exo)类DNA酶检测,关键是酶切产物分离–检测。[方法]本研究以1/1000 Cy5-dATP的dNTPs扩增5851 bp荧光Cy5DNA pET28a-xyn。基于纯化柱吸附DNA原理,首先确定2倍P3缓冲液(2×P3)为纯化柱吸附DNA最小用量,进而用纯化柱以2×P3分离Cy5DNA溶液、等量Cy5DNA经T5exo酶切反应液(Cy5DNA-T5exo),分别得到洗脱液(含有Cy5DNA)和滤出液(含有酶切产物Cy5-dATP)。[结果]酶标仪定量检测显示,含120 ng Cy5DNA洗脱液荧光值5824、滤出液0。含120 ng Cy5DNA-T5exo滤出液荧光值7573、洗脱液0。激光共聚焦显微镜定性检测显示,Cy5DNA洗脱液有荧光、滤出液无。Cy5DNA-T5exo滤出液有荧光、洗脱液无。定量和定性检测结果与纯化柱吸附DNA、滤出酶切产物原理和功能相同。进而分析了Cy5DNA浓度、Cy5-dATP浓度与荧光值的定量关系。[结论]荧光Cy5DNA成功扩增,其酶切产物经纯化柱以2×P3成功分离,为荧光DNA扩增和用于DNA酶活性检测奠定了基础。
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