一种美洲大蠊中治疗肺纤维化活性部位的提取及纯化方法

技术领域

本发明属于美洲大蠊提取及纯化技术领域，具体涉及一种美洲大蠊中治疗肺纤维化活性部位的提取及纯化方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana L.)为昆虫纲，蜚蠊目，蜚蠊科，俗称蟑螂。《神农本草经》将其列入中品，曰:主血瘀，症坚、寒热，破积聚，喉咽痹。《本草纲目》中亦有记载，蜚蠊又名茶婆虫、香娘子，其主治“瘀血，症坚，寒热，下气，利血脉”，其制剂“康复新液”内服用于治疗淤血阻滞，胃痛出血，胃、十二指肠溃疡，及对阴虚肺痨、肺结核的辅助治疗作用。课题前期对美洲大蠊的研究中发现，其提取物对转化生长因子-β1(Transforming growthfactor-Beta1,TGF-β1)诱导的人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HEL)增殖过程中COL-I mRNA和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)CTGF-mRNA的表达具有明显的抑制作用，并筛选得到了抗肺纤维化活性部位，命名为ML-HB。然而，现有技术并未对其提取和纯化工艺进行系统研究。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种美洲大蠊中治疗肺纤维化活性部位的提取及纯化方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种美洲大蠊中治疗肺纤维化活性部位的提取及纯化方法，包括步骤：A、活性部位提取：

a、将美洲大蠊与溶剂混合后，恒温回流提取后，合并滤液；

b、将所述合并滤液减压浓缩，石油醚脱脂取水层，得到活性滤液；

c、将活性滤液浓缩后，经大孔树脂吸附，用洗脱剂洗脱后用MTT法筛选得到洗脱部位ML-HB的活性液；

B、活性部位纯化：所述洗脱部位ML-HB的活性液用大孔树脂纯化，经过上样、吸附后分别用杂质洗脱剂和ML-HB洗脱剂洗脱，浓缩，冷冻干燥后，得到冻干粉；上样量为1/4BV-1/8BV。

进一步的，所述溶剂为C原子数小于4的醇或C原子数小于4的醇与水的混合物。

进一步的，所述溶剂为甲醇、乙醇、乙二醇、甲醇水溶液、乙醇水溶液或乙二醇水溶液。

进一步的，所述步骤B的杂质洗脱剂是如下重量比例的组分混合物：水：40wt％C原子数小于4的醇的溶液：60wt％C原子数小于4的醇的溶液＝1:1.3:1.5；ML-HB洗脱剂为：C原子数小于4的醇或90wt％-99wt％的C原子数小于4的醇与水的混合液。

进一步的，所述步骤B的杂质洗脱剂是如下重量比例的组分混合物：水：40wt％C乙醇溶液：60wt％乙醇溶液＝1:1.3:1.5；ML-HB洗脱剂为：乙醇或90wt％-99wt％乙醇溶液。

进一步的，所述步骤A中美洲大蠊与溶剂的重量比为1:4-6；所述溶剂为乙醇的水溶液，乙醇的水溶液中乙醇的质量分数为40-60％；提取的时间为1-3h,提取次数为3次以上，恒温回流的温度为50-70℃。

进一步的，所述步骤B中上样量为1/4-1/5BV，洗脱流速为每分钟1/50-3/50BV，杂质洗脱剂用量1BV-1.5BV，ML-HB洗脱剂为1.5-2.5BV，吸附时间8-12h。

进一步的，所述步骤A中美洲大蠊与溶剂的重量比为1:5；所述溶剂为乙醇的水溶液，乙醇的水溶液中乙醇的质量分数为50％；提取的时间为2.5h,提取次数为3次，恒温回流的温度为60℃。

进一步的，所述步骤B中上样量为1/5BV，洗脱流速为每分钟1/50BV，杂质洗脱剂用量1.3BV，ML-HB洗脱剂为2BV，吸附时间10h。

上样时，所述洗脱部位ML-HB的活性液与大孔树脂的重量比为1:4-8，即上样量为1/4BV-1/8BV。

本发明的有益效果为：本发明的一种美洲大蠊中治疗肺纤维化活性部位的提取及纯化方法，将活性相近的ML-D₅、ML-D₆及ML-D₇三者进行工艺合并，得到活性相当活性部位ML-HB通过体外活性追踪，以得率为指标，确定最佳提取条件为：60℃的提取温度、50％质量分数的乙醇溶液、提取时间2.5h、提取3次，ML-HB的得率为0.58％；以得率为指标结合体外活性考察，在单因素实验的基础上，对影响美洲大蠊抗肺纤维化活性部位分离的因素：确定最佳纯化条件为：上样量1/5BV，洗脱流速每分钟1/50BV，杂质洗脱剂用量1.3BV，95％乙醇用量2BV，吸附时间10h。可将ML-HB的得率从0.58％提高到0.75％。从而本发明具有得率高，提纯效果好的特点。

附图说明

图1是提取分离工艺流程图。

图2是提取温度对ML-HB得率的影响图。

图3是不同溶剂浓度对ML-HB得率的影响图。

图4是不同提取时间对ML-HB得率的影响图。

图5是不同提取次数对ML-HB得率的影响图。

图6是不同上样量对ML-HB得率的影响图。

图7是不同洗脱流速对ML-HB得率的影响图。

图8是不同杂质洗脱剂用量对ML-HB得率的影响图。

图9是不同吸附时间对ML-HB得率的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐释。

实施例

一、美洲大蠊抗肺纤维化活性部位的提取分离

1.实验材料：美洲大蠊(Periplaneta Americana)药材(云南省大理州弥渡县美蠊养殖基地提供)，样品性状：冻干粉。

2.美洲大蠊药材的提取：称取美洲大蠊药材适量，粉碎，用5倍量溶剂于60℃恒温水浴锅中回流提取3次，提取时间分别为2h、1h、1h，趁热过滤，合并滤液，于60℃下减压浓缩，回收溶剂，石油醚脱脂，取下层液离心沉降，取上清液减压浓缩至一定浓度，经大孔树脂吸附过夜，用不同浓度的洗脱剂进行梯度洗脱，共得7个洗脱部位，分别命名为ML-D₁、ML-D₂、ML-D₃、ML-D₄、ML-D₅、ML-D₆和ML-D₇，冷冻干燥，得冻干粉，称重，提取率见表2-2，提取工艺流程如图1所示。

表2-2美洲大蠊洗脱物提取率

二、抗肺纤维化活性部位的合并研究

对ML-D1、ML-D2、ML-D3、ML-D4、ML-D5、ML-D6和ML-D7进行体外活性筛选，ML-D5、ML-D6和ML-D7具有较强的抑制HEL细胞增殖作用(具体见提取工艺优化和纯化工艺优化部分)，故将这三个部位进行工艺合并，命名为ML-HB，提取率约为0.52％。

表2-3美洲大蠊合并洗脱物提取率(n＝3)

三、美洲大蠊抗肺纤维化活性部位提取工艺优化

2实验方法

2.1 ML-HB溶液的配制

称取ML-HB冻干粉适量，用含1％FBS DMEM培养基溶解，配成浓度为1000μg/ml的溶液，用0.22μm的滤头过滤，依次稀释成浓度为160μg/ml、150μg/ml、140μg/ml、130μg/ml、120μg/ml的样品溶液，现配现用。

2.3提取工艺单因素实验

2.3.1提取温度考察 称取药材粉末4份，每份200.0g，用5倍量溶剂恒温水浴回流提取3次，提取时间2h、1h、1h，提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃(固定其它条件)，浓缩、脱脂，大孔树脂分离纯化，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，并进行体外实验。

2.3.2提取溶剂浓度考察 称取200.0g药材粉末5等份，分别用5倍量浓度为50％、60％、70％、80％和95％的溶剂水浴回流提取3次(提取2h、1h、1h)，固定其它条件，浓缩脱脂，大孔树脂分离纯化，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，并进行体外实验。

2.3.3提取时间考察 称取药材粉末5份，每份200.0g，用5倍量浓度为50％的溶剂60℃回流提取3次，提取时间分别为1h、1.5h、2h、2.5h和3h，固定其它条件，浓缩、脱脂，大孔树脂分离纯化，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，并进行体外实验。

2.3.4提取次数考察 称取药材粉末3份，每份200.0g，用5倍量浓度为50％的溶剂60℃回流提取，提取次数分别为1次、2次、3次，提取时间为2.5h，固定其它条件，浓缩、脱脂，大孔树脂分离纯化，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率。

2.4提取正交实验

在单因素考察的基础上，对影响美洲大蠊抗肺纤维化活性部位的提取因素：溶剂浓度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)进行L9(3⁴)的正交实验考察，正交实验因素和水平设计见表3-1。

表3-1提取正交因素水平表

2.5提取工艺验证

按最佳提取工艺条件进行验证，经大孔树脂吸附、洗脱，冷冻干燥，平行3份，计算得率，进行体外实验。

3结果分析

3.1单因素实验

3.1.1提取温度考察 实验结果见图2可知，活性部位的得率随温度的升高而缓慢降低。这可能是由于温度的升高，导致部分活性物质分解。因此可选用50℃或60℃作为最佳提取温度，还应综合体外实验结果分析。

体外实验见表3-2、3-3和3-4，在实验剂量下，60℃和70℃得到的ML-HB，不同时间点的IC50值相对较小，在110.5～123.9μg/ml之间，IC50值无差异，50℃和80℃得到的ML-HB的IC50值相对较大，在122.2～134.3μg/ml之间，结合图2得率分析，确定60℃作为最佳提取温度。

表3-2不同温度所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表3-3不同温度所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表3-4不同温度所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.1.2溶剂浓度考察 由图3可知，50％、60％和70％其得率无显著差异，最高得率为0.55％；当溶剂浓度达80％时得率呈大幅度降低，结合体外实验分析选择最佳溶剂浓度。

体外实验结果见表3-5、3-6和3-7，由表可知，不同浓度溶剂提取得到的活性部位ML-HB，对HEL的抑制作用随溶剂浓度增大而减弱，70％、80％和95％所得的ML-HB在实验剂量下，对HEL几乎无抑制作用；50％所得ML-HB在24、48和72h的IC₅₀值相对60％小，分别为118.6μg/ml、107.2μg/ml、103.1μg/m。结合图3得率分析，选用50％作为最佳提取的溶剂浓度。

表3-7不同溶剂浓度所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表3-7不同溶剂浓度所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表3-7不同溶剂浓度所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.1.3提取时间考察 由图4可知，ML-HB的得率先随提取时间的延长而增加，当提取时间达2.5h时得率达最大值，但随着提取时间继续延长活性部位的提取率又缓慢下降，可能提取时间较长导致部分活性成分分解，结合体外活性结果选择最佳提取时间。

体外实验结果见表3-8、3-9和3-10，由表可知，提取1h和1.5h得到的ML-HB不同时间点的IC50值均大于130μg/ml；提取2h、2.5h和3h得到的ML-HB 24、48和72h对HEL的IC50值分别在117.7～122.2μg/ml、104.3～122.2μg/ml和94.7～100.0μg/ml之间，表明提取时间为2h、2.5h和3h时，ML-HB对HEL细胞的抑制作用无显著性差异。综合图4得率分析，确定2.5h为最佳提取时间。

表3-8不同提取时间所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表3-9不同提取时间所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表3-10不同提取时间所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.1.4提取次数考察由图5可知，随提取次数的增加，ML-HB的得率也增加，故选择提取3次作为最佳实验条件。

3.2提取正交实验

极差分析见表3-11，由表可知，以得率为指标时，影响因素大小顺序为：C>B>A，即提取次数对ML-HB的提取率影响最大，依次是提取时间和溶剂浓度，从k值分析得工艺为A₁B₂C₃。方差分析见表3-12，结果表明提取次数对ML-HB得率的影响具有显著差异(P<0.01)，提取时间对其得率影响具有统计学意义(P<0.05)。

表3-11提取正交试验结果及极差分析

表3-12提取正交试验方差分析

由表3-13、3-14和3-15可知：在实验剂量下，正交工艺7、8和9提取的ML-HB对HEL的IC₅₀值均大于150μg/ml；正交工艺1、2、3和5提取的ML-HB在24h、48h、72h时的IC₅₀值相对较小，分别在121.1～126.0μg/ml、109.2～119.6μg/ml和91.9～95.9μg/ml之间。结合表3-11得率分析，正交工艺5提取的ML-HB得率最高，工艺为A₂B₂C₃。正交工艺1、2、3提取的ML-HB对HEL的IC₅₀值均与正交5相当，工艺1、2、3溶剂浓度均是A₁，结合单因素对溶剂考察结果，A₁和A₂的得率无显著差异，但A₁提取的ML-HB其体外活性相对较强，故最终确定最佳提取工艺为A₁B₂C₃，即50％的溶剂浓度，提取2.5h，提取3次。

表3-13提取正交实验所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表3-14提取正交实验所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表3-15提取正交实验所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.3提取工艺验证

对“3.2”项确定的最佳提取工艺A₁B₂C₃进行验证，结果见表3-16，ML-HB提取率均值为0.58％，对工艺验证得到的ML-HB进行活性验证。

表3-16验证实验ML-HB的得率(n＝3)

对正交工艺1、2、3、5和工艺验证提取的ML-HB平行体外活性实验，正交工艺1、2、3、5对HEL细胞24、48、72h的IC₅₀值分别在123.9～129.2μg/ml、111.7～128.0μg/ml和93.6～95.3μg/ml之间，工艺验证得到的3组ML-HB对HEL细胞24、48、72h的IC₅₀值分别在117.6～120.1μg/ml、94.5～108.2μg/ml和88.2～92.7μg/ml之间，均比正交工艺组的IC₅₀值小，但无显著差异。结果表明，优选的提取工艺稳定、可行、合理。

因此，经单因素实验和正交实验的筛选，确定ML-HB最佳提取工艺A1B2C3，即60℃下溶剂浓度为50％，提取时间为2.5h，提取3次。工艺验证表明提取率由原来的0.52％提高到0.58％，体外活性实验表明ML-HB对HEL细胞的IC50值与原工艺相当。

四、美洲大蠊抗肺纤维化活性部位分离纯化工艺优化

1实验材料和仪器

秋水仙碱(规格为0.5mg/片，西双版纳版纳药业有限责任公司，批号：20160318)；其它见第二章。

2实验方法

2.1美洲大蠊粗提物的提取

称取适量的药材粉末，按第三章的最佳提取工艺的条件(60℃下，50％的溶剂提取3次，每次提取2.5h)进行提取，浓缩、脱脂，作为储备液备用。

2.2秋水仙碱溶液

取规格为0.5mg/片的秋水仙碱20片，研细，加10ml含1％FBS的DMEM溶解，离心，取上清液，用0.22μm的无菌微孔滤头过滤，得1000μg/ml的母液，实验时再用含1％FBS的DMEM配成150μg/ml、140μg/ml、130μg/ml、120μg/ml、110μg/ml的溶液。

2.3大孔树脂分离ML-HB的单因素实验

2.3.1上样量考察 按1/8、1/7、1/6、1/5、1/4BV的样料比，(样品溶液:树脂)分别量取“2.1”项下的储备液5份，上样，吸附过夜，用1.5BV的杂质洗脱剂和2BV的ML-HB洗脱剂以每分钟1/50BV的流速进行洗脱，浓缩，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，进行体外实验。

2.3.2洗脱流速考察 按1/6BV的样料比量取“2.1”项下的储备液5份，上样，吸附过夜，用1.5BV的杂质洗脱剂和2BV的ML-HB洗脱剂，分别以每分钟1/30、1/40、1/50、1/60、1/70BV的流速进行洗脱，浓缩，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，进行体外实验。

2.3.3杂质洗脱剂用量考察 按1/6BV的样料比量取“2.1”项下的储备液3份，上样，吸附过夜，分别用1、1.3、1.5BV的杂质洗脱剂和2BV的ML-HB洗脱剂，以每分钟1/50BV的流速进行洗脱，浓缩，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，进行体外实验。

2.3.4 ML-HB洗脱剂用量考察 按1/6BV的样料比量取“2.1”项下的储备液2份，上样，吸附过夜，1.3BV的杂质洗脱剂，分别用2BV和3BV的ML-HB洗脱剂，以每分钟1/50BV的流速进行洗脱，浓缩，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率。

2.3.5吸附时间考察 按1/6BV的样料比量取“2.1”项下的储备液3份，上样，分别吸附6h、8h、10h，用1.3BV的杂质洗脱剂和2BV的ML-HB洗脱剂以每分钟1/50BV的流速进行洗脱，浓缩，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，进行体外实验。

2.4分离正交实验

在单因素实验基础上，对上样量、洗脱流速、杂质洗脱剂用量和吸附时间四个因素进行L9(3⁴)正交实验，正交因素水平设计如表4-1所示。

表4-1分离纯化正交实验因素水平表

2.5分离工艺验证

按1/5BV的样料比量取“2.1”项下的储备液3份，以最佳分离工艺进行验证，浓缩，冷冻干燥，得冻干粉，计算得率，进行体外实验。

3实验结果及分析

3.1单因素实验

3.1.1上样量考察 由图6可知，ML-HB的得率随上样量的增大而增加，当增大到1/4BV时其得率反而降低，考虑大孔树脂吸附已达饱和；并且样料比为1/5和1/6BV时提取的ML-HB的得率无显著差异，结合体外实验分析，选择最佳上样量。

体外实验由表4-2、4-3和4-4可知，在实验剂量下，上样量为1/8、1/7、1/6、1/5和1/4BV提取的ML-HB，其24h的IC₅₀值在116.4～119.9μg/ml之间，48h的IC₅₀值在101.1～112.4μg/ml之间，72h的IC₅₀值在90.8～94.4μg/ml之间，可认为不同上样量所得ML-HB的体外活性无显著差异。结合图6得率分析，选择1/6BV或1/5BV为下一步的实验条件。

表4-2不同上样量所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表4-3不同上样量所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表4-4不同上样量所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.1.2洗脱流速考察 由图7可知，ML-HB的得率随洗脱流速增大先缓慢增加，当增加到1/50BV时其得率反而降低。可能是流速过慢时，洗脱时间太长导致部分活性成分再次被树脂吸附，延长洗脱时间；流速过快时会导致部分活性成未被洗脱，洗脱效率低，浪费洗脱剂，故结合体外实验，分析选择最佳洗脱流速。

体外实验由表4-5、4-6和4-7可知，在实验剂量下，不同洗脱流速得到的ML-HB，其24、48和72h的IC₅₀值分别在114.3～117.4μg/ml、101.4～112.3μg/ml和89.0～94.8μg/ml之间。结果表明，洗脱流速对ML-HB的活性影响无显著差异。结合图7得率分析，可选用每分钟1/50BV的流速作为下一步实验条件。

表4-5不同洗脱流速所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表4-6不同洗脱流速所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表4-7不同洗脱流速所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.1.3杂质洗脱剂用量考察 由图8可知，ML-HB的得率随杂质洗脱剂用量的增大而降低。考虑杂质洗脱剂用量少时部分杂质可能未洗脱完全，用量多时部分活性成分可能被冲走。结合体外实验分析选择最佳杂质洗脱剂用量。

体外实验结果由表4-8、4-9和4-10可知，不同杂质洗脱剂用量所得的ML-HB作用HEL细胞24、48、72h时，1BV得到的ML-HB其IC₅₀值分别为138.3μg/ml、135.6μg/ml和128.0μg/ml，1.3BV得到的ML-HB其IC₅₀值分别为114.2μg/ml、104.5μg/ml和95.1μg/ml，1.5BV得到的ML-HB其IC₅₀值分别为110.0μg/ml、105.2μg/ml和88.6μg/ml。结果表明，1BV得到的ML-HB体外活性相对较弱，可能是杂质未洗脱完全，1.3BV和1.5BV的ML-HB体外活性无显著性差异。综合图8得率分析，可选择1.3BV为下一步实验条件。

表4-8不同洗脱剂用量所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表4-9不同洗脱剂用量所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表4-10不同洗脱剂用量所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.1.4 ML-HB洗脱剂用量考察 由表4-11可知，当ML-HB洗脱剂用量为2BV、3BV时，ML-HB得率无显著差异，认为活性成分已洗脱完全，故选择ML-HB洗脱剂用量为2BV。

表4-11不同ML-HB洗脱剂用量对ML-HB得率的影响

3.1.5吸附时间考察 由图9可知，吸附时间在6h～10h范围内，ML-HB的得率随吸附时间的延长缓慢增加，但8和10h已无差异。吸附时间太短时，可能未吸附完全导致得率相对较低，故选择10h为最佳吸附时间，结合体外实验对其进行分析。

由表4-12、4-13和4-14可知，在实验剂量下，吸附不同时间得到的ML-HB 24h的IC₅₀值在112.4～116.2μg/ml之间，48h的IC₅₀值在108.8～114.3μg/ml之间，72h的IC₅₀值在89.8～92.1μg/ml之间，由结果可知吸附时间对ML-HB的体外活性影响无差异。结合图9得率分析，选择得率较高的10h作为最佳吸附时间。

表4-12不同吸附时间所得ML-HB 24h对HEL的影响(n＝5)

表4-13不同吸附时间所得ML-HB 48h对HEL的影响(n＝5)

表4-14不同吸附时间所得ML-HB 72h对HEL的影响(n＝5)

3.2分离纯化的正交实验结果

实验结果见表4-15，由极差分析可知，以得率为指标时，影响因素大小的顺序为：A>B＝C>D。即上样量对ML-HB的得率影响最大，其次是洗脱流速和洗脱剂用量，吸附时间影响最小，从k值分析得分离优化工艺为：A₂B₂C₁D₁。方差分析见表4-16，结果表明上样量对ML-HB得率的影响具有统计学意义(P<0.05)，其它三个因素对其得率的影响无统计学意义。

体外实验结果见表4-17、4-18和4-19，由表可知，在实验剂量下，9个正交工艺提取的ML-HB在24、48、72h对HEL均有较强的抑制作用，作用相对较弱的为正交工艺1、6和8，其三个时间点的IC₅₀值分别在129.9～134.6μg/ml、124.1～138.8μg/ml、114.5～132.2μg/ml之间，均比其他工艺提取的ML-HB大，3个工艺中C因素均为C₁(表4-15)，认为杂质洗脱剂用量少，导致杂质洗脱不完全；正交工艺3、5和9提取的ML-HB，其IC₅₀值相对较小，24、48和72h分别在115.9～123.7μg/ml、102.0～118.9μg/ml、91.7～96.5μg/ml之间，表明三个工艺得到的ML-HB体外活性无显著差异。其中，正交工艺5得到的ML-HB得率最高(0.71％)，其工艺为A₂B₂C₃D₁。

综合单因素实验分析，A₂、B₂为最佳上样量和最佳洗脱流速；C₂与C₃相比，C₂提取的ML-HB得率较高，且C₂和C₃提取的ML-HB活性相当，故选择C₂为杂质洗脱剂用量；吸附时间太短导致吸附不完全，故选择D₃作为吸附时间，因此，确定分离纯化工艺为：A₂B₂C₂D₃，并对其进行验证。

表4-15分离纯化正交实验结果计算

3.3分离纯化工艺验证结果

对工艺A₂B₂C₂D₃进行验证，即上样量为1/5BV，吸附10h，用1.3BV的杂质洗脱剂和2BV的ML-HB洗脱剂以每分钟1/50BV的流速进行洗脱。由表4-20可知，ML-HB的得率均值为0.75％，比未进行优化的分离工艺高出0.17％，见表3-16。

表4-20分离验证实验ML-HB得率

体外实验由表4-21、4-22和4-23可知，在实验剂量下，验证工艺得到的ML-HB作用HEL细胞24、48、72h的IC₅₀值分别在107.2～115.4μg/ml、92.0～104.1μg/ml和87.1～90.1μg/ml之间，比“3.2”项工艺A₂B₂C₃D₁得到的ML-HB的IC₅₀小。结果还表明，当给药剂量为120μg/ml～150μg/ml，作用24、48h时，验证工艺得到的ML-HB对HEL细胞的抑制作用较秋水仙碱强，作用72h时，ML-HB和秋水仙碱对HEL细胞的抑制作用相当。

结论：

经单因素实验和正交实验的筛选，确定ML-HB最佳提取工艺A₁B₂C₃，即60℃下溶剂浓度为50％，提取时间为2.5h，提取3次。工艺验证表明提取率由原来的0.52％提高到0.58％，体外活性实验表明ML-HB对HEL细胞的IC₅₀值与原工艺相当。

优化ML-HB的纯化工艺，摸索出大孔树脂纯化除杂实验的最佳洗脱条件：上样量1/5BV，洗脱流速每分钟1/50BV，杂质洗脱剂用量1.3BV，95％乙醇用量2BV，吸附时间10h。工艺验证提取的ML-HB得率从0.58％提高到0.75％，其体外活性与原工艺相当。

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。